重組大腸桿菌酶法催化產(chǎn)谷胱甘肽.pdf

1、谷胱甘肽是參與細(xì)胞活動(dòng)的最普遍的非蛋白巰基化合物，是機(jī)體內(nèi)重要的活性三肽，因其抗氧化作用而在醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用，生物合成是制備谷胱甘肽的主要方法，一直引起廣泛關(guān)注。本研究的主要內(nèi)容是克隆表達(dá)不同來(lái)源的谷胱甘肽合成相關(guān)的酶，比較不同重組菌催化產(chǎn)谷胱甘肽的產(chǎn)量，并對(duì)新型雙功能谷胱甘肽合成酶進(jìn)行了相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)的研究，最后通過(guò)催化優(yōu)化提高新型重組菌的谷胱甘肽產(chǎn)量。
　　本文將來(lái)自E.coliK12的谷胱甘肽合成酶相關(guān)基

2、因gshA，gshB和來(lái)自Streptococcusthermophilus的雙功能酶基因gshF克隆，構(gòu)建得到五種重組菌，分別為Rosetta（pET-gshA），Rosetta（pET-gshB），BL21（pET-gshA），BL21（pET-gshB），BL21（pET-gshF），通過(guò)在不同宿主菌中表達(dá)，在添加前體氨基酸和ATP的條件下，比較得到來(lái)自gshF的重組菌酶法產(chǎn)谷胱甘肽的產(chǎn)量比gshA，gshB的兩種混合菌分別高23

3、.8％和5.4％。
　　接著本文將新型雙功能酶GshF在EcoliBL21中表達(dá)，并對(duì)表達(dá)條件做了優(yōu)化。研究表明，重組菌于37℃培養(yǎng)4h后經(jīng)0.1mMIPTG誘導(dǎo)，然后在30℃下表達(dá)，胞內(nèi)酶活可達(dá)44U/L。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)破胞、離心、親和層析等步驟分離純化后，進(jìn)一步考察了其相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果表明，該酶的最適pH為8.0，最適溫度為37℃，論文還研究了其在最適pH和溫度下的穩(wěn)定性。結(jié)果為該酶在37℃條件下，40min內(nèi)降解，pH為8的條

4、件下于4℃保存幾天，酶活幾乎不變，穩(wěn)定性較強(qiáng)。
　　最后本文對(duì)新型重組菌BL21(pET-gshF)全細(xì)胞催化產(chǎn)谷胱甘肽做了催化條件優(yōu)化。通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)初始pH，前體反應(yīng)物(ATP、Cys)的濃度，得到最佳的酶催化反應(yīng)條件:100mMKH2PO4buffer(pH8.0),60mMGlu,30mMCys,40mMGly,20mMMgCl2,30mMATP。調(diào)初始反應(yīng)pH為8.0。最終催化得到谷胱甘肽的產(chǎn)量為2.11g/L。該研究對(duì)該