糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；冈诖竽c桿菌中的表達(dá)及其分離純化.pdf

1、糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes faecalis,Af)青霉素G酰化酶(PGA)具有獨(dú)特的酶學(xué)性質(zhì),預(yù)示著其在半合成抗生素工業(yè)有著良好的應(yīng)用前景.該文將糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；?AfPGA)基因構(gòu)建表達(dá)載體pKKFPGA和pSMLFPGA,pKKFPGA和pSMLFPGA均含trc啟動(dòng)子、青霉素G?；富?、rrnB轉(zhuǎn)錄終止子,其中pKKFPGA含有氨卞青霉素抗性基因和colE1高拷貝復(fù)制子;而pSMLFPGA含有四環(huán)素抗性基因和p

2、15A中拷貝復(fù)制子.兩重組質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化宿主菌DH5 α,由于重組質(zhì)粒和宿主菌DH5 α均不含lacI<'q>調(diào)控基因,重組菌不產(chǎn)生阻遏蛋白,控制表達(dá)的trc啟動(dòng)子始終處于"開(kāi)"狀態(tài),因而所得重組菌DH5 α/pKKFPGA和DH5 α/pSMLFPGA不需誘導(dǎo)便能組成型表達(dá)PGA.對(duì)基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化,中性pH、低溫、慢速利用型碳源(淀粉、蔗糖、糊精)、磷酸鹽、MgSO4等促進(jìn)重組菌表達(dá)AfPGA.玉米漿顯著地促進(jìn)AfPGA在菌

3、株DH5á/pSMLFPGA的表達(dá),卻抑制AfPGA在菌株DH5á/pKKFPGA的表達(dá).與玉米漿相反,尿素有利于菌株DH5á/pKKFPGA表達(dá)fPGA,卻不利于菌株DH5a/pSMLFPGA對(duì)AfPGA的表達(dá).通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定菌株DH5á/pKKFPGA的最佳產(chǎn)酶條件為蛋白胨10g/L、酵母膏7.5g/L、基礎(chǔ)鹽0.75V/V、MgSO<,4>2g/L、糊精20g/L,菌株DH5á/pSMLFPGA的最佳產(chǎn)酶條件為蛋白胨20g/L、

4、酵母膏5g/L、基礎(chǔ)鹽0.75V/V、MgSO<,4>1.5g/L、糊精40g/L.在優(yōu)化的條件下,青霉素G?；冈诰闐H5 α/pKKFPGA和DH5 α/pSMLFPGA中的表達(dá)量分別達(dá)4000U/L和4800U/L,對(duì)應(yīng)的菌體表達(dá)量達(dá)600U/L/A600.菌體重懸于50mmol/L磷酸氫二鈉溶液,冰浴中超聲破碎菌體,離心,上清即為粗酶液.粗酶液無(wú)需硫酸銨沉淀及透析,即可引入磷酸緩沖液(50mmol/L,pH7.8)預(yù)平衡的DE

5、AE-Sepharose CL 6B柱,上柱后用平衡緩沖液洗至基線穩(wěn)定.AfPGA不被吸附而直接流出.流出液加入固體(NH<,4>)<,2>SO<,4>至1mol/L后,加入50mmol/L磷酸緩沖液pH7.8-1mol/L(NH<,4>)<,2>SO<,4>預(yù)平衡的Butyl-Sepharose CL 4B柱,分步洗脫,在(NH<,4>)<,2>SO<,4>濃度為0的磷酸緩沖液洗脫獲得AfPGA.經(jīng)DEAE-Sepharose CL

6、6B離子交換層析和Butyl-Sepharose CL 4B疏水層析,即可得純度提高20倍、比活為68.6U/mg的青霉素G?；?兩步純化的總得率達(dá)91％.菌體破碎液離心,沉淀部分和上清液分別進(jìn)行Western blot分析.Western印跡分析表明對(duì)于菌株DH5 α/pKKFPGA,5-10％的原前體青霉G素?；冈诎麅?nèi)形成了包涵體,說(shuō)明其成熟的限速步驟在胞內(nèi)的運(yùn)輸階段,而菌株DH5 α/pSMLFPGA則無(wú)明顯包涵體形成,說(shuō)明菌