抗腫瘤新藥—豹蛙酶在大腸桿菌中的克隆表達(dá)及分離純化.pdf

1、豹蛙酶(Onconase)是一種能夠有效地抑制人白血病細(xì)胞和人腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的核糖核酸酶，尤其對(duì)惡性間皮瘤療效顯著，目前已進(jìn)入Ⅲ期臨床研究階段。本實(shí)驗(yàn)采用基因工程方法使豹蛙酶在大腸桿菌中得到高效表達(dá)，并研究其分離純化工藝，得到生物活性較好的重組豹蛙酶蛋白。
　　 設(shè)計(jì)重組豹蛙酶的結(jié)構(gòu)，在天然豹蛙酶序列前端添加腸激酶酶切位點(diǎn)，根據(jù)其氨基酸序列，采用大腸桿菌偏愛密碼子設(shè)計(jì)合成8段引物，采用重疊延伸PCR法合成出目的基因，約350bp。

2、將得到的片斷克隆于載體pGEM-T中并測(cè)序，再連接至表達(dá)載體pET-22b(+)中，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosettatm(DE3)中。轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌以IPTG誘導(dǎo)外源基因表達(dá)，采用Tricine-SDS-PAGE系統(tǒng)，分析目標(biāo)蛋白主要以包涵體形式存在。溫度為37℃時(shí)，pH為7.0，以物質(zhì)的量濃度為0.5mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4h，目的基因在大腸桿菌中的表達(dá)最佳，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)48.8％。利用液相電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜方式(LC-ESI

3、-MS/MS)鑒定蛋白，通過LCQ DECA XP Plus系統(tǒng)進(jìn)行蛋白序列的分析，其覆蓋率達(dá)到35％，確定了其蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的正確性。
　　 通過對(duì)重組豹蛙酶的表達(dá)模式的研究，進(jìn)一步確定其分離純化工藝。包涵體經(jīng)洗滌、變性、復(fù)性，使用腸激酶將融合蛋白部分切除，再采用SPFF強(qiáng)陽離子交換層析純化，硫酸銨沉淀濃縮后，再通過Sephadex G-25分子篩收集活性組分，得到了純度97.5％的豹蛙酶蛋白，發(fā)酵總產(chǎn)量達(dá)255mg/L，并具