嗜酸硫化芽孢桿菌硫氧化還原酶的功能研究.pdf

1、嗜酸硫化芽孢桿菌(Sulfobacillus acidophilus TPY)是一株分離自太平洋熱液口，中等嗜熱嗜酸的革蘭氏陽性菌，既能利用亞鐵鹽、單質(zhì)硫自養(yǎng)生長，也能利用酵母粉、葡萄糖、蛋白胨和甘油等有機(jī)物異養(yǎng)生長。因此，TPY菌株對(duì)亞鐵和單質(zhì)硫的良好氧化能力顯示出其在生物浸礦中的應(yīng)用潛力。嗜酸硫化芽孢桿菌的硫氧化還原酶在有氧條件下催化單質(zhì)硫反應(yīng)生成亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽和硫化氫。
　　為研究硫氧化還原酶在硫氧化過程中的作用，克隆

2、硫氧化還原酶基因，并表達(dá)純化，復(fù)性得到有活性的硫氧化還原酶，經(jīng)過亞甲基藍(lán)比色法驗(yàn)證體外制備的硫氧化還原酶是有活性的。并憑借免疫共沉淀技術(shù)研究硫氧化還原酶的功能，挖掘出組氨酸蛋白激酶與硫氧化還原酶的關(guān)系密切。
　　通過定點(diǎn)突變技術(shù)，發(fā)現(xiàn)嗜酸硫化芽孢桿菌硫氧化還原酶(SOR)的活性位點(diǎn)(C31、C101、C104、H86、H90、E114)與已報(bào)道的古菌及革蘭氏陰性菌的相似，而六個(gè)活性位點(diǎn)突變蛋白的活性與已報(bào)道的古菌及革蘭氏陰性菌的差

3、別較大，這也正體現(xiàn)了這個(gè)來自于革蘭氏陽性菌的硫氧化還原酶的特殊性。
　　首先構(gòu)建出可轉(zhuǎn)移的表達(dá)載體pTrc99A_sor_oriT，通過接合轉(zhuǎn)移的方法，將所構(gòu)建的載體成功轉(zhuǎn)入了嗜酸硫化芽孢桿菌中，構(gòu)建了嗜酸硫化芽孢桿菌基因工程菌S.a cidoph ilus(p Trc99A_sor_oriT)，并對(duì)基因工程菌的硫氧化活性及理化參數(shù)進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無論是以FeSO4還是S為能源物質(zhì)的培養(yǎng)基上，嗜酸硫化芽孢桿菌基因工程菌S

4、.acidophilus(pTrc99A_sor_oriT)的硫氧化活性有一定程度的提高，這也充分說明，通過提高硫氧化途徑的起始酶SOR的表達(dá)量，可以提高嗜酸硫化芽孢桿菌的硫氧化活性。
　　為了進(jìn)一步探究基因工程菌硫氧化活性提高的原因，運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)基因工程菌中硫代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，在基因工程菌S.acidophf lus(p Trc99A_sor_oriT)中，除了質(zhì)粒上所攜帶的目的基因的表達(dá)水

5、平有提高以外，硫代謝的其它相關(guān)基因的表達(dá)水平也有一定的變化。在FeSO4為能源物質(zhì)的SA培養(yǎng)基上，基因工程菌S.acidophilus(pTrc99A_sor_oriT)中，只有質(zhì)粒上所攜帶的目的基因的表達(dá)水平提高了，其它硫代謝基因表達(dá)水平下調(diào)。在S為能源物質(zhì)的SA培養(yǎng)基上，基因工程菌S.acidophilus(pTrc99A_sor_oriT)中，除了質(zhì)粒上所攜帶的目的基因的表達(dá)水平提高了，其它硫代謝基因表達(dá)水平也得到一定程度的提高，