基于DNA擴(kuò)增信號(hào)放大檢測(cè)環(huán)境重金屬離子適體生物傳感器研究.pdf

1、重金屬離子在環(huán)境中具有富集性、長久性、廣泛性和嚴(yán)重性，其污染越來越引起大家的關(guān)注和重視，而發(fā)展及時(shí)、簡單、準(zhǔn)確、高靈敏和高選擇性的測(cè)定環(huán)境中重金屬離子濃度方法是預(yù)防、控制和處理重金屬污染的基礎(chǔ)、前提甚至是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。與傳統(tǒng)的重金屬離子分析檢測(cè)方法相比，電化學(xué)和電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器兼?zhèn)淞穗娀瘜W(xué)、電致化學(xué)發(fā)光分析和適體的優(yōu)點(diǎn)，具有檢測(cè)及響應(yīng)速度快、操作簡便、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，在重金屬離子檢測(cè)分析領(lǐng)域有較大的應(yīng)用可行性，是當(dāng)前最具應(yīng)用

2、前景的檢測(cè)方法之一。目前，單純利用適體結(jié)合目標(biāo)物前后構(gòu)象變化引起信號(hào)的增強(qiáng)或減弱，在進(jìn)一步提高靈敏度方面已經(jīng)十分有限。因此，為了進(jìn)一步提高適體生物傳感器的靈敏度，實(shí)現(xiàn)痕量檢測(cè)重金屬離子，需要采用一些信號(hào)放大策略。雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Hybridization chain reaction，HCR)是一種可在常溫下進(jìn)行反應(yīng)，不需要控制溫度變化和其他催化酶的輔助，僅依靠一對(duì)交叉互補(bǔ)的寡核苷酸(Deoxyribonucleic acid，DNA)探

3、針便可對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行放大檢測(cè)的擴(kuò)增信號(hào)放大方法，它為構(gòu)建簡單、高靈敏電化學(xué)(Electrochemical，EC)和電致化學(xué)發(fā)光(Electrochemiluminescence，ECL)適體傳感器用于重金屬離子檢測(cè)提供了可能。基于此，本論文以HCR為基本放大策略，結(jié)合仿酶催化信號(hào)放大等構(gòu)建了一系列EC和ECL適體傳感器，旨在構(gòu)建系列簡單、可靠、快速、高靈敏和高選擇性的適體生物傳感器用于同一敏感界面一種或多種重金屬離子的檢測(cè)，并采用加標(biāo)回

4、收法或?qū)Νh(huán)境樣品進(jìn)行檢測(cè)對(duì)其初步應(yīng)用進(jìn)行研究。圍繞本研究目的本文主要從EC和ECL適體生物傳感器敏感界面的構(gòu)建，重金屬離子與堿基的特異結(jié)合性及仿酶催化和新型DNA擴(kuò)增信號(hào)放大策略等方面進(jìn)行了探索和研究。具體的研究內(nèi)容如下:
　　(1)卟啉鐵/G-四分體是由卟啉鐵及一段富含鳥嘌呤G堿基的核苷酸組合而成的復(fù)合物，對(duì)電子傳遞具有一定的阻礙作用。因此，以鐵氰化鉀([Fe(CN)6]4-/3-)為氧化還原探針，結(jié)合HCR在電極表面原位產(chǎn)生卟

5、啉鐵/G-四分體DNA納米線用于信號(hào)放大構(gòu)建了一種簡單、快速的電化學(xué)交流阻抗(Electrochemical ImpedanceSpectroscopy，EIS)適體傳感器用于Ag+的高靈敏檢測(cè)。在有目標(biāo)物Ag+存在時(shí)，Ag+與富含胞嘧啶C堿基的捕獲DNA探針和溶液中的引物DNA產(chǎn)生錯(cuò)配形成穩(wěn)定的C-Ag+-C復(fù)合物，從而將引物DNA成功修飾于電極表面引發(fā)HCR形成卟啉鐵/G-四分體DNA納米線。由于卟啉鐵/G-四分體DNA納米線能夠有

6、效阻礙電極表面電子傳遞，得到增大的交流阻抗值，根據(jù)阻抗值的增大就可以完成對(duì)目標(biāo)物的定量檢測(cè)。該制備的傳感器構(gòu)建簡單、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)、重現(xiàn)性及穩(wěn)定性優(yōu)良。實(shí)驗(yàn)表明，該傳感器對(duì)Ag+具有較寬的檢測(cè)范圍和較低的檢測(cè)限:線性范圍為0.1 nM～100μM，檢測(cè)限為0.05 nM。與其他一些已報(bào)道的適體傳感器相比較，該制備的傳感器在靈敏度和線性范圍等性能指標(biāo)上都明顯優(yōu)于對(duì)比傳感器，說明卟啉鐵/G-四分體DNA納米線能有效阻礙電子傳遞，得到

7、增強(qiáng)的交流阻抗值。此外，還通過加標(biāo)回收法對(duì)所制備的傳感器初步應(yīng)用進(jìn)行了研究，回收率在90.1％至108.0％之間，結(jié)果較為理想，表明所制備的傳感器具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，有望應(yīng)用于環(huán)境中重金屬離子的定量檢測(cè)。
　　(2)卟啉鐵/G-四分體除了具有一定阻礙電子傳遞的作用，還可以模擬辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)活性催化過氧化氫水解，且我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)電致化學(xué)發(fā)光分析方法比電化學(xué)方法更為靈敏。因此，

8、本文結(jié)合HCR在電極表面原位產(chǎn)生卟啉鐵/G-四分體DNA納米線，利用卟啉鐵/G-四分體模擬HRP酶活性催化魯米諾發(fā)光構(gòu)建了一種新型電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器用于Ag+的高靈敏檢測(cè)。首先將富含C堿基的捕獲DNA探針組裝在電沉積納米金(dep Au)修飾的玻碳電極表面。通過堿基的特異性互補(bǔ)配對(duì)，將引物DNA鏈組裝在電極上作為HCR的引發(fā)鏈，從而在電極表面原位產(chǎn)生大量的卟啉鐵/G-四分體DNA納米線用于模擬HRP活性。在含有H2O2和魯米諾的測(cè)試

9、底液中，卟啉鐵/G-四分體呈現(xiàn)良好的HRP模擬酶活性，迅速催化H2O2產(chǎn)生大量的自由基(ROSs)，促進(jìn)魯米諾發(fā)光，得到增強(qiáng)的電致化學(xué)發(fā)光響應(yīng)信號(hào)。當(dāng)目標(biāo)物Ag+存在時(shí)，Ag+與相鄰的兩條捕獲DNA探針錯(cuò)配形成穩(wěn)定的C-Ag+-C復(fù)合結(jié)構(gòu)，從而使得卟啉鐵/G-四分體納米線離開電極表面，卟啉鐵/G-四分體固載量減少，得到降低的電致化學(xué)發(fā)光響應(yīng)信號(hào)用于定量檢測(cè)Ag+。該傳感器具有較高的靈敏度和良好的選擇性:線性范圍為2 pM～20μM，檢測(cè)

10、限達(dá)到0.67 pM。與前一個(gè)體系所構(gòu)建的電化學(xué)交流阻抗適體傳感器相比，其線性范圍明顯變寬，檢測(cè)限更低，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境中重金屬離子的痕量檢測(cè)。
　　(3)卟啉錳（MnTMPyP）是一種典型的以錳離子為中心原子的卟啉類化合物。它能直接鑲嵌于AT或CG堿基對(duì)溝槽中，并呈現(xiàn)出良好的辣根過氧化物酶HRP活性，快速催化過氧化氫水解。與之前常用的具有HRP催化活性的卟啉鐵/G-四分體相比，卟啉錳修飾在DNA雙鏈中不需要特定的DNA序列。而且，

11、由于卟啉錳能直接鑲嵌于AT或CG堿基對(duì)溝槽中，其在DNA雙鏈中的固載量大大增加，為構(gòu)建簡單、高靈敏、高催化效率的電化學(xué)傳感器提供了可能。在這個(gè)體系中，結(jié)合HCR在電極表面原位產(chǎn)生DNA納米線用于共固載卟啉錳、硫堇，利用卟啉錳模擬HRP酶活性催化信號(hào)放大，構(gòu)建了一種新型電化學(xué)適體傳感器用于汞離子(Hg2+)的定量檢測(cè)。富含T堿基的捕獲DNA探針首先通過Au-S鍵作用組裝于納米金(nano-Au)修飾的玻碳電極(GCE)表面。接著，引物DN

12、A鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)被修飾于電極表面以引發(fā)HCR，在電極表面生成卟啉錳/硫堇共固載的DNA納米線。在檢測(cè)底液中存在H2O2時(shí)，修飾在DNA納米線上的卟啉錳模擬HRP活性，催化H2O2水解，從而促進(jìn)電子媒介體硫堇的氧化還原反應(yīng)，得到放大的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)。當(dāng)有目標(biāo)物Hg2+存在時(shí)，Hg2+誘導(dǎo)相鄰的捕獲DNA探針形成T-Hg2+-T復(fù)合物，從而將卟啉錳/硫堇共固載的DNA納米線解離電極表面，得到減小的電化學(xué)信號(hào)以實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+的定量檢測(cè)。結(jié)

13、果表明，所構(gòu)建的電化學(xué)適體生物傳感器對(duì)其他金屬離子具有較強(qiáng)的抗干擾性，對(duì)Hg2+表現(xiàn)出較高的靈敏度、優(yōu)良的選擇性和較低的檢測(cè)限:線性范圍為5 pM～50μM，檢測(cè)限達(dá)到2.5 pM。
　　(4)一般構(gòu)建的傳感器大多只能檢測(cè)一種重金屬離子，而在環(huán)境中有可能存在多種重金屬離子的污染。因此，構(gòu)建一種傳感器能同時(shí)檢測(cè)多種重金屬離子具有非常重要的意義，因?yàn)樗艽蟠罂s短分析時(shí)間，降低檢測(cè)成本并提高檢測(cè)效率。本章節(jié)結(jié)合HCR在電極表面原位產(chǎn)生D

14、NA納米線用于信號(hào)放大，利用不同電活性物質(zhì)在同一緩沖液中出現(xiàn)不同出峰電位，構(gòu)建了一種簡單、快速、多組分檢測(cè)的電化學(xué)適體傳感器用于實(shí)現(xiàn)同一敏感界面Ag+和Hg2+同時(shí)檢測(cè)。兩條DNA單鏈?zhǔn)紫茸越M裝在金納米粒子修飾的電極表面，一條是巰基修飾的富含C堿基的DNA鏈(C1)，能與互補(bǔ)的DNA鏈(P1)部分雜交，另一條是巰基修飾的富含T堿基的DNA鏈(C2)，能與互補(bǔ)的DNA鏈(P2)部分雜交(P1和P2分別為對(duì)應(yīng)的引物DNA鏈)。緊接著加入四條

15、輔助的DNA鏈（蒽醌-2-羧酸標(biāo)記的LS1和LS2以及硫堇標(biāo)的LS3和LS4）進(jìn)行HCR反應(yīng)，在電極表面原位生成分別含有大量蒽醌-2-羧酸和硫堇修飾的DNA納米線。采用蒽醌-2-羧酸標(biāo)記的DNA納米線在-0.45V電位下檢測(cè)Ag+和硫堇標(biāo)記的DNA納米線在-0.2V電位下檢測(cè)Hg2+。在沒有目標(biāo)物Ag+和Hg2+時(shí)，高的蒽醌-2-羧酸和硫堇的信號(hào)都能被檢測(cè)到。然而，在只有Ag+存在時(shí)，電極表面的C1發(fā)生錯(cuò)配形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使得蒽醌-2-羧

16、酸標(biāo)記的DNA納米線離開電極表面，得到降低的電化學(xué)信號(hào)，硫堇信號(hào)值遠(yuǎn)比蒽醌-2-羧酸的信號(hào)大。當(dāng)只有Hg2+存在時(shí)，電極表面的C2發(fā)生錯(cuò)配形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使得硫堇標(biāo)記的DNA納米線離開電極表面，-0.2V的硫堇信號(hào)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于-0.45V的蒽醌-2-羧酸信號(hào)。Ag+和 Hg2+同時(shí)存在時(shí)，蒽醌-2-羧酸和硫堇的信號(hào)值都很低，根據(jù)相應(yīng)應(yīng)電化學(xué)信號(hào)的減小就可以完成同一敏感界面兩種重金屬離子的同時(shí)定量檢測(cè)。所構(gòu)建的傳感器構(gòu)建簡單、靈敏度高、能夠用于