基于適體的無標(biāo)記生物傳感器的研究.pdf

1、蛋白質(zhì)是一種構(gòu)成生命體的基本物質(zhì)，蛋白質(zhì)的測(cè)定對(duì)生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域的研究具有非常重要的意義。適體是一類核酸分子，他們能與特定的分子綁定。與抗體相比，適體的穩(wěn)定性更高，并且易于修飾到電極上，成為了理想的蛋白質(zhì)識(shí)別物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于活體鑒定和疾病診斷。基于適體對(duì)生物分子進(jìn)行識(shí)別的適體傳感器，其靈敏度受信號(hào)傳遞物質(zhì)影響。
　　 溶菌酶分子量大約為14.4 kDa，含有129個(gè)氨基酸殘基，等電點(diǎn)為11.0。通過催化肽聚糖中N-乙酰氨基葡萄糖

2、殘基間和N-乙酰胞壁酸，以及促使殼糊精中N-乙酰葡糖胺殘基間的1，4-β鏈的水解，從而破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁。溶菌酶廣泛分布于人體中，例如細(xì)胞分泌液，唾液、眼淚以及其他一些體液中都含有不同濃度的溶菌酶。溶菌酶具有較強(qiáng)的抗菌性，因此在食品行業(yè)及醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)被廣泛使用。在各種蛋白質(zhì)中，溶菌酶分子相對(duì)比較小，結(jié)構(gòu)也較為簡(jiǎn)單，因此在檢測(cè)蛋白質(zhì)的適體傳感器的研究中，其常被當(dāng)做標(biāo)準(zhǔn)目標(biāo)檢測(cè)物。
　　 腺苷(Adenosine)是核苷的一種，由腺嘌

3、呤和核糖（呋喃核糖）的一部分組成。三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)由腺苷和三個(gè)磷酸基組成，化學(xué)式C10H16N5O13P3，ATP的化學(xué)名稱為5'-三磷酸-9-β-D-呋喃核糖基-6-氨基嘌呤，分子量507.18，其在生物化學(xué)上扮演著重要角色，例如以腺苷三磷酸(ATP)或腺苷雙磷酸(ADP)形式進(jìn)行轉(zhuǎn)移能量。
　　 日本科學(xué)家飯島澄男于1991年發(fā)現(xiàn)碳納米管。根據(jù)M.Endo等人的定義，如果石墨

4、六角網(wǎng)平面（石墨烯片）卷成無縫筒狀時(shí)形成無缺陷的“單層”管狀物質(zhì)亦或是將其包覆在內(nèi)，層層套疊而成的“多層”管狀物質(zhì)，此二種管狀物質(zhì)即為碳納米管。
　　 本文將適體和層層自組裝技術(shù)相融合，用于制備溶菌酶及三磷酸腺苷傳感器。研究思路為:(1)利用適體高效的識(shí)別性，作為蛋白質(zhì)的識(shí)別元件，制備出具有較高靈敏度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性的蛋白質(zhì)傳感器，用于定量檢測(cè)溶菌酶、三磷酸腺苷;(2)以亞甲基藍(lán)、道諾霉素及三價(jià)釕離子為電信號(hào)物質(zhì)，利用它們?cè)谶m體

5、上吸附的特性，研制非標(biāo)記型蛋白質(zhì)傳感器。
　　 本文主要研究?jī)?nèi)容包括以下三個(gè)部分:
　　 1基于適體的無標(biāo)記溶菌酶電化學(xué)傳感器在玻碳電極表面電沉積金納米顆粒，通過金硫鍵將帶巰基的適體DNA鏈固定到電極上，用6-巰基-1-己醇封閉，成功制備了基于溶菌酶適體的信號(hào)減弱型電化學(xué)傳感器。采用掃描電子顯微鏡表征金納米顆粒修飾電極;以交流阻抗、循環(huán)伏安法等手段研究了傳感器的電化學(xué)特性。以微分脈沖伏安法(DPV)作為檢測(cè)方法，傳感器D

6、PV電流信號(hào)隨著溶菌酶濃度增加而減少。該傳感器測(cè)定溶菌酶的濃度線性范圍為0.1～100 nM，最低檢測(cè)限為0.01 nM（3倍信噪比），相關(guān)系數(shù)為0.9876。對(duì)諸如葡萄糖氧化酶等蛋白質(zhì)有較好的抗干擾能力。
　　 2基于適體競(jìng)爭(zhēng)機(jī)理的溶菌酶電化學(xué)傳感器成功制備了基于溶菌酶適體競(jìng)爭(zhēng)機(jī)理的信號(hào)減弱型電化學(xué)傳感器。在玻碳電極上修飾羧基化的多壁碳納米管，將帶有氨基的互補(bǔ)適體DNA連接到多壁碳納米管上。由于道諾霉素崁入電極上的互補(bǔ)DNA，

7、而產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)。當(dāng)有目標(biāo)物時(shí)，適體與結(jié)合力更高的溶菌酶結(jié)合，原本的互補(bǔ)鏈解鏈，導(dǎo)致插入雙鏈的道諾霉素脫落，電化學(xué)信號(hào)減弱。以微分脈沖伏安法(DPV)測(cè)定溶菌酶，響應(yīng)的范圍為1～500 nM，相關(guān)系數(shù)0.9995，檢測(cè)下限為0.5 nM（3倍信噪比）。
　　 3基于適體的無標(biāo)記三磷酸腺苷電化學(xué)檢測(cè)器在金盤電極表面修飾帶巰基的雙鏈DNA，用6-巰基己醇封閉未結(jié)合DNA的活性位點(diǎn)。然后通過DNA雜交使適體DNA鏈鏈接到金盤電極表面。