綠色木霉菌黃色素的發(fā)酵優(yōu)化、提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定.pdf

1、本文以綠色木霉菌(Trichoderma viride)為試驗(yàn)菌株，首先對其所產(chǎn)生的黃色素進(jìn)行發(fā)酵動力學(xué)特征的研究，然后對綠色木霉菌進(jìn)行定向培養(yǎng)使其產(chǎn)生更多的黃色素，在最優(yōu)培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件下對黃色素發(fā)酵液進(jìn)行提取、分離和物質(zhì)鑒定，得出綠色木霉菌黃色素5個組分物質(zhì)組成結(jié)構(gòu)，為開發(fā)一種新型的微生物代謝產(chǎn)生的天然色素提供研究依據(jù)。本文的主要研究成果如下：
　　 1、綠色木霉菌(T．viride)黃色素發(fā)酵液不同稀釋倍數(shù)的溶液在29

2、0nm及380nm處有最大吸收峰，該黃色素最大吸收波長與已有較多報道的紅曲黃色素的最大吸收波長(370、388nm)相近。在T．viride產(chǎn)黃色素的液態(tài)發(fā)酵過程中，通過測定菌體干重、吸光值（色價）、殘?zhí)菨舛群蚿H值，得到T．viride液態(tài)發(fā)酵過程中菌體生長、黃色素合成和底物消耗的動力學(xué)參數(shù)變化曲線。從發(fā)酵過程曲線可以得出綠色木霉菌體生長和黃色素的合成屬于部分生長偶聯(lián)型。
　　 2、在培養(yǎng)基碳源、氮源組成，裝液量及搖床轉(zhuǎn)速、接

3、種量、培養(yǎng)時間及培養(yǎng)溫度等單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 設(shè)計及響應(yīng)面分析法優(yōu)化T．viride產(chǎn)天然黃色素的培養(yǎng)基組成和發(fā)酵工藝條件。結(jié)果表明，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，T．viride產(chǎn)黃色素的優(yōu)化培養(yǎng)條件為：馬鈴薯液態(tài)培養(yǎng)基（250 g·L-1 馬鈴薯浸汁，2g·L-1Na2HPO4），外加碳源選擇21.7 g·L-1木糖，搖瓶裝液量為50 mL/250 mL，培養(yǎng)溫度35℃，接種量6％(v/v)，搖床轉(zhuǎn)速120 r·min-

4、1，培養(yǎng)時間152 h。在優(yōu)化培養(yǎng)條件下發(fā)酵液黃色素的色價為52.8±0.8 U·mL-1。馬鈴薯培養(yǎng)基中添加尿素、硫酸銨、蛋白胨、牛肉浸粉等氮源會抑制黃色素的生成。
　　 3、利用薄層層析與紅外及紫外光譜聯(lián)用的方法快速、高效地獲得了綠色木霉菌黃色素物質(zhì)成分的主要信息。通過對紅外光譜譜圖解析可知，三個色素成分譜圖曲線大致相同，每個物質(zhì)又有不同的吸收譜帶，黃色素物質(zhì)中出現(xiàn)了羥基、氨基、甲基、亞甲基、羧基及烯鍵、炔鍵、苷鍵、酯鍵的特

5、征峰，各物質(zhì)又不同程度地含有芳香骨架，其在紫外掃描光譜中也得到了印證。由此可知色素物質(zhì)含有的官能團(tuán)較多，結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜。在紫外光譜掃描中，三個明顯的紫外吸收峰位置及強(qiáng)度表明了該類色素物質(zhì)為含有由少到多環(huán)的芳香烴類物質(zhì)，其中成分b、c 兩者都是稠環(huán)芳烴，可能是萘、蒽、菲等并各自有不同的取代基及官能團(tuán)。
　　 4、通過對綠色木霉菌的黃色素及代謝物的溶劑提取及分步萃取，及正相柱層析、葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱層析和高效液相

6、色譜（HPLC）的分離方法，應(yīng)用電子噴霧質(zhì)譜（ESI-MS），1H-1H COSY，13C-1H COSY，HMBC和 NOESY在內(nèi)的一維和二維核磁共振技術(shù)進(jìn)行鑒定，共得到 5個純品化合物。分別為:化合物 E1-2、2,4-已二烯酸、Viridenepoxydiol、Sorbiquinol、Vertinolide。其中E1-2為從未報道的新化合物，且E1-2、Sorbiquinol、Vertinolide 均為首次從T．viride中