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1、近年來隨著環(huán)糊精的應(yīng)用越來越廣泛,β-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶作為β-環(huán)糊精生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵酶也因此成為了國(guó)內(nèi)外研究者的熱點(diǎn)。
論文通過PCR方法從溫控型工程菌 DH5α/pBV220cgt中得到蠟狀芽孢桿菌的β-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶基因,并將其連接到pET-22b(+)載體中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-22b/cgt,先轉(zhuǎn)入E.coli DH5α中,經(jīng)過氨芐抗性篩選和酶切驗(yàn)證及序列分析后,轉(zhuǎn)化到 E.coli BL21(DE3)中,獲得能表達(dá)
2、該酶的重組工程菌株 E.coli BL21(DE3)/pETcgt。
通過對(duì)工程菌培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件的考察,得到該菌株高效表達(dá)重組酶的最佳培養(yǎng)基配方:0.03％氯化鈣,1%氯化鈉,0.5%酵母膏,1%胰蛋白胨;最佳誘導(dǎo)條件是:誘導(dǎo)溫度25℃、誘導(dǎo)開始時(shí)菌濃 OD600=1.7、 IPTG濃度0.2mmol/L和誘導(dǎo)時(shí)間12h。重組酶酶活力達(dá)到最高為5239U/mL,比優(yōu)化前酶活提高了24.6倍。其中培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶活力影響最大
3、。
在獲取最佳產(chǎn)酶條件的基礎(chǔ)上,對(duì)菌體進(jìn)行破碎處理后提取粗酶液,粗酶液經(jīng)過(NH4)2SO4鹽析、透析和Sephadex G-100凝膠柱純化后,得到重組酶純品,SDS-PAGE電泳顯示該重組酶分子量約為68kDa。該重組酶的最適溫度和pH分別為60℃和9.0;在溫度低于70℃、pH在7.0-9.0之間時(shí)該酶較穩(wěn)定;Ca2+能一定程度的促進(jìn)酶活力,Mg2+和Mn2+對(duì)酶活力有中度的抑制作用,而 Cu2+, Zn2+, Fe2+
4、, Al3+和Fe3+能強(qiáng)烈的抑制酶活力;動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km=2.8439mg/mL,Vmax=0.1874mg/mL·min-1。
論文最后對(duì)β-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的催化產(chǎn)物進(jìn)行了初步研究,通過對(duì)重組酶催化淀粉的產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn),產(chǎn)物中除含有3種混合的環(huán)糊精外,至少還含有單糖和10個(gè)聚合度以下的低聚糖;其中β-環(huán)糊精是主要產(chǎn)物,α-環(huán)糊精的量很少。重組酶催化條件的研究表明:在60oC、pH9.0反應(yīng)條件下,300U/g的β-環(huán)糊精糖基
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