美洲大赤魷來(lái)源新型硫酸軟骨素的制備及抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性研究.pdf

1、癌癥是導(dǎo)致全球人口死亡率升高的一個(gè)重要原因。癌癥之所以是人類久攻不下的難題與其自身的特性有很大的關(guān)系，其中最為棘手的特性是癌細(xì)胞能不斷遷移并侵入正常組織形成新的病灶。研究發(fā)現(xiàn)，在這一過(guò)程中腫瘤細(xì)胞與相應(yīng)的正常組織在硫酸軟骨素(CS)的含量、組成、分子大小等方面有明顯差異。通常，這種CS組成和結(jié)構(gòu)上的差異與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。這一特性使得CS的抗腫瘤活性成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。已有研究表明，CS分子的硫酸化模式、分子量大小等決定了C

2、S的抗腫瘤活性。其中，CS-E硫酸化程度高、硫酸化模式復(fù)雜，且抗腫瘤活性強(qiáng)、抑瘤譜廣，成藥價(jià)值高。但是，目前商品化的CS-E主要來(lái)自一種名為太平洋褶皺魚（Todarodes Pacificus）的野生小型魷魚，價(jià)格昂貴，無(wú)法大規(guī)模生產(chǎn)。隨著海洋污染加劇，這類CS-E的原料來(lái)源受到更加嚴(yán)重的威脅。更為重要的是，關(guān)于CS-E寡糖的抗腫瘤研究較少。
　　本課題通過(guò)優(yōu)選CS原料，建立CS的分離、純化工藝，制備得到高純度富含[GlcAβ1-

3、3GalNAc(4S，6S)](E-unit)的新型CS，分析了其理化性質(zhì)。同時(shí)，優(yōu)化了CS寡糖制備工藝，分離純化出富含E-unit的CS寡糖。此外，在分子和動(dòng)物個(gè)體水平系統(tǒng)分析了這一新型CS及其寡糖的抗腫瘤活性，探討了相關(guān)機(jī)理。具體如下:
　　1.新型富含E-unit硫酸軟骨素(Novel E-unit-rich CS，NER-CS)多糖的制備與純度分析:以美洲大赤魷（Dosidicus Gigas）在食品加工過(guò)程中的軟骨廢棄物

4、為原料，建立包括粉碎、脫水脫脂、酶解、除蛋白、醇沉、離子交換、脫鹽等操作流程的CS制備方法，制備得到新型CS。最終產(chǎn)品的產(chǎn)率達(dá)到16±2％。用商品化的硫酸軟骨素ABC酶、硫酸皮膚素酶、透明質(zhì)酸酶（來(lái)自于StreptomycesHyalurolyticus）、以及實(shí)驗(yàn)室自有產(chǎn)權(quán)的rHCLase降解所得多糖，根據(jù)酶的底物專一性，確認(rèn)所制備的多糖為CS;通過(guò)咔唑反應(yīng)檢測(cè)樣品中新型CS含量，BCA蛋白定量法檢測(cè)樣品中蛋白含量。結(jié)果提示:樣品中新

5、型CS含量達(dá)到97％以上，蛋白含量低于2％。
　　2.新型CS多糖結(jié)構(gòu)的初步分析:參照葡聚糖分子量標(biāo)準(zhǔn)物，經(jīng)凝膠過(guò)濾HPLC分析，確定所制備的NER-CS多糖平均分子量約為623.2 kDa。再通過(guò)硫酸軟骨素ABC酶完全降解，結(jié)合HPLC分析二糖組成，發(fā)現(xiàn)NER-CS主要含有[GlcAβ1-3GalNAc]、[GlcAβ1-3GalNAc(4S)]、[GlcAβ1-3 GalNAc(6S)]、E-unit，其中E-unit含量最高

6、可達(dá)44.5％，同時(shí)[GlcAβ1-3GalNAc]、[GlcAβ1-3 GalNAc(4S)]、[GlcAβ1-3 GalNAc(6S)]含量分別為7.1％、12.6％、35.8％，總硫酸化度為1.37。是一種新型高硫酸化CS。
　　3.NER-CS生物活性的初步分析:1）用Aglyco試劑盒檢測(cè)NER-CS的抗凝血活性，結(jié)果顯示:NER-CS抗FⅡa和抗FⅩa活性分別為20±2 U/mg和0.9±0.2 U/mg，是陽(yáng)性對(duì)照肝

7、素抗FⅡa活性的10％左右，抗FⅩa活性的4％左右;2）利用乳腺癌4T1細(xì)胞試驗(yàn)轉(zhuǎn)移模型，分析NER-CS在小鼠體內(nèi)抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性，結(jié)果顯示:50、100和200μg NER-CS的抑瘤率分別為54.3±2.5％、75.1±3.5％、42.9±2.1％，同時(shí)陽(yáng)性對(duì)照100μg肝素的抑瘤率為74.6±1.8％;3）用親和素修飾的CM5芯片固定生物素化NER-CS，分析NER-CS與五種生長(zhǎng)因子、三種選擇素的相互作用活性，結(jié)果顯示NER-C

8、S與生長(zhǎng)因子HGF、bFGF相互作用活性較高，親和力常數(shù)分別為(3.47±1.73)×10-6、(5.39±2.92)×10-8。
　　4.NER-CS寡糖的制備及其抗腫瘤活性分析:建立了一種制備CS寡糖的方法，采用高酶活的rHCLase，通過(guò)單因子實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了降解產(chǎn)生E-unit CS寡糖所需的酶用量與反應(yīng)時(shí)間，分離純化出不同聚合度的系列CS寡糖，分析了二糖組成，最后檢測(cè)了系列寡糖的抗腫瘤活性。結(jié)果表明120 mg NER-CS和

9、40μg的rHCLase在含0.5 MNaCl的PBS反應(yīng)液中，于37℃下反應(yīng)8h后可獲得聚合度為2-18的系列寡糖，100μg的NER-CS八糖、十糖、十二糖、十四糖及多糖的抑瘤率分別為70.3±3.8％、74.0±2.6％、83.2±3.6％、74.8±4.6％和75.7±3.7％。
　　綜上所述，本課題優(yōu)選成本低廉、產(chǎn)量大的美洲大赤魷軟骨為原料，建立了NER-CS的制備方法，得到了富含E-unit新型CS。NER-CS與生長(zhǎng)