高產(chǎn)酒精酵母菌的分子改造及一步發(fā)酵菊粉或木薯淀粉生產(chǎn)酒精.pdf

1、燃料乙醇作為生物能源的一種,具有悠久的歷史,但一直以來燃料乙醇生產(chǎn)成本較高,無法與傳統(tǒng)燃料形成競爭優(yōu)勢。據(jù)分析,以淀粉質(zhì)為原料生產(chǎn)燃料乙醇,原料和能耗成本可占總成本的90％,因此采用更廉價(jià)的原料并降低能耗是降低燃料乙醇生產(chǎn)成本的主要途徑。菊芋(Helianthus tuberosus Linn)和木薯(Manihot esculenta Crantz)作為生產(chǎn)燃料乙醇的原料作物,具有很好的發(fā)展?jié)摿?。目?工業(yè)上發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的主要微生物為

2、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),但是釀酒酵母不能直接利用菊粉和淀粉,構(gòu)建可分泌菊粉酶或淀粉酶的基因工程菌株,可以解決彌補(bǔ)這個(gè)缺陷。
　　本論文首先利用基因敲除技術(shù)構(gòu)建了二倍體高產(chǎn)酒精釀酒酵母WO菌株的尿嘧啶缺陷型菌株W12d,并構(gòu)建了基于rDNA和δ序列的并可以與W12d尿嘧啶缺陷互補(bǔ)的多位點(diǎn)整合型表達(dá)載體pMIRSC21、pMIRSCll和pMIDSCll。利用W12d和這些載體成功構(gòu)建了可以直接利用

3、菊粉或淀粉的釀酒酵母工程菌株,并成功用于糖化菊粉或木薯淀粉發(fā)酵生產(chǎn)酒精。
　　從海洋藻類藻表面分離得到的季也蒙畢赤酵母(Pichia guilliermondii)菌株1可以向培養(yǎng)基分泌大量的菊粉酶。利用pMIRSC2l,將海洋季也蒙畢赤酵母strainl菊粉酶基因INUl整合到釀酒酵母W12d染色體上表達(dá)后,重組子PgulNU14S－04在YPI液體培養(yǎng)基中,28℃條件下,以180rpm振蕩培養(yǎng)72h,菊粉酶活力可達(dá)34.5±0

4、.3U/mL,且PgulNU14S-04產(chǎn)酶能力穩(wěn)定。在5－L發(fā)酵罐中,利用PgulNU14S-04同步糖化30％(w/v)菊粉發(fā)酵生產(chǎn)酒精,經(jīng)120h發(fā)酵,酒精濃度最終可以達(dá)到14.7士0.5％(v/v,20℃),乙醇轉(zhuǎn)化率為1g菊粉可生產(chǎn)0.386g乙醇;同樣條件下,發(fā)酵50％菊芋干粉提取物,可以得到12.6±0.4％(v/v,20℃)的酒精,總糖利用率91.9±0.5％,乙醇轉(zhuǎn)化率為1g糖可生產(chǎn)0.331g酒精。通過對(duì)表達(dá)載體和.

5、INUI基因進(jìn)行改造,得到了產(chǎn)菊粉酶能力更強(qiáng)的轉(zhuǎn)化子PgulNU14SM-R27,在同樣培養(yǎng)條件下,菊粉酶酶活可以達(dá)到42.3±0.4U/mL比PguINU14S－04提高了22.6％。利用PguINU14SM－R27同步糖化30％(w/v)菊粉發(fā)酵生產(chǎn)酒精,最終可以得到濃度為14.8士0.2％(v/v,20℃)的酒精,乙醇轉(zhuǎn)化率為1g菊粉可生產(chǎn)0.389g乙醇,發(fā)酵時(shí)間比PguINU14S－04縮短了12h。
　　扣囊復(fù)膜孢酵母

6、(Saccharomycopsisfibuligera)IFO0111糖化酶Glm可以催化水解生淀粉,而扣囊復(fù)膜孢酵母A11菌株a-淀粉酶Alpl可以加快淀粉的液化。本論文同時(shí)利用表達(dá)載體pMIRSCll、pMlDSCll實(shí)現(xiàn)了扣囊復(fù)膜孢酵母All菌株a-淀粉酶基因ALPI和IFO0111菌株糖化酶基因GLM在釀酒酵母W12d中的共表達(dá),篩選到一個(gè)淀粉酶活性較高的轉(zhuǎn)化子AMY-39,經(jīng)72h振蕩培養(yǎng),a-淀粉酶活性可達(dá)22.54±0.5