龍須菜多糖的分離純化、結構鑒定、生物活性及作用機制研究.pdf

1、龍須菜(Gracilaria lemaneiformis Weber-van Boss)是江蘺屬（Gracilaria）的一種溫帶性紅藻，屬紅藻門(Rhodophta)、真紅藻綱(Florideophyceae)、杉藻目(Gigartinales)、江籬科(Gracilariales)。龍須菜分布于中國、日本等國，在我國原產于山東省沿海，近年來在廣東、福建等省實現(xiàn)規(guī)?；B(yǎng)殖，產量逐年增加。其主要用途是作為瓊膠生產的原料，鮑魚飼料及綠色食

2、品開發(fā)，也可作為金屬富集器。龍須菜的研究才剛剛起步，目前國外未見有關龍須菜生物活性方面的研究報道，國內也只有少數(shù)學者對龍須菜多糖的生物活性進行了初步研究，發(fā)現(xiàn)其具有抗突變、抗腫瘤、清除自由基和抗氧化作用，但有關龍須菜多糖提高免疫力和多糖純化方面的報道甚少。本文對龍須菜粗多糖進行了分離純化和化學結構研究，并重點研究了龍須菜多糖的免疫調節(jié)活性，同時探討了體外抗氧化以及體外抗腫瘤活性，以期為龍須菜活性多糖的開發(fā)提供更廣泛的理論和實驗依據(jù)。

3、r>　　1、龍須菜多糖的提取、分離及理化性質研究
　　龍須菜多糖提取工藝研究表明，室溫提取比高溫提取多糖具有更好的刺激小鼠淋巴細胞增殖作用，且提取率更高，因此本文選擇室溫作為龍須菜多糖提取溫度，經(jīng)L9(34)正交試驗優(yōu)化獲得室溫下龍須菜多糖提取最佳工藝，即料液比1∶20，提取時間12h，提取次數(shù)3次，多糖得率為9.96％。
　　通過比較一步脫硫酸基法和兩步脫硫酸基法對龍須菜粗多糖硫酸基脫除效果發(fā)現(xiàn)，采用兩步脫除方法可以得到較

4、理想的硫酸基脫除效果和較好的多糖回收率，硫酸基脫除率最高達72.9％，多糖回收率達48.9％。
　　采用超濾分級、DEAE-陰離子交換柱層析和凝膠柱層析等純化方法對龍須菜多糖進行了系統(tǒng)的分離純化。龍須菜室溫提取粗多糖GCp經(jīng)超濾分級獲得GCpF1（1-10萬）和GCpF2（＞10萬），經(jīng)DEAE-陰離子交換柱層析GCpF1被分為5個組份（GCpF1-1、GCpF1-2、GCpF1-3、GCpF1-4和GCpF1-5），GCpF2被

5、分為4個組份(GCpF2-1、GCpF2-2、GCpF2-3和GCpF2-4)，進一步凝膠層析獲得三種均一多糖，GCpF1-1B、GCpF2-1B和GCpF2-3B。紫外掃描顯示GCpF2-1B和GCpF2-3B在280nm和260nm處沒有吸收峰，表明兩種均一多糖不含蛋白質和核酸，或含量極低。經(jīng)HPLC測定GCpF1-1B、GCpF2-1B和GCpF2-3B的分子量分別為9.3×104 Da、1.10×105Da和1.03×105 D

6、a。
　　2、多糖結構的研究
　　通過單糖組成分析、紅外光譜和核磁共振（一維:1H NMR譜、13C NMR譜;二維:1H-1H COSY譜、TOCSY譜、NOESY譜、HMQC譜和HMBC譜）方法，對GCpF2-1B和GCpF2-3B的結構進行了解析。
　　紅外光譜顯示，GCpF2-1B具有典型的吡喃糖環(huán)特征和硫酸基特征吸收峰。進一步分析顯示GCpF2-1B一級結構主要由[→3）-β-D-吡喃半乳糖(G)-(1→4)

7、-α-L-3，6-內醚吡喃半乳糖(A)-（1→]重復單元和[→3）-β-D-吡喃半乳糖（G*）-(1→4)-6-硫酸-α-L-吡喃半乳糖（A*）-（1→]組成，其中A*∶A=1∶1.5。
　　多糖GCpF2-3B與GCpF2-1B一級結構相似，也主要由[→3）-β-D-吡喃半乳糖(G)-(1→4)-α-L-3，6-內醚吡喃半乳糖(A)-（1→]重復單元和[→3）-β-D-吡喃半乳糖（G*）-(1→4)-6-硫酸-α-L-吡喃半乳糖

8、（A*）-（1→]組成，但A*∶A=1∶2.0。
　　3、多糖生物活性研究
　　室溫下浸提多糖GCp刺激小鼠淋巴細胞增殖的作用優(yōu)于采用傳統(tǒng)熱水浸煮工藝和高溫高壓(121℃)提取工藝獲得的多糖，且后兩者刺激作用相當。GCp經(jīng)超濾分級獲得組份GCpF1和GCpF2的刺激小鼠脾淋巴細胞增殖活性高于Sevag法脫蛋白處理后所得樣品GCp-S和凍融處理后所得樣品GCp-1和GCp-2，也高于GCp，表明超濾分級適合龍須菜粗品的初步分離

9、，活性成分得到有效保留。GCpF1和GCpF2經(jīng)DEAE離子柱層析后所得組份均保持了較好的刺激小鼠淋巴細胞增殖作用，其中水相洗脫組份GCpF1-1和GCpF2-1活性明顯高于其他洗脫組份，同時也略優(yōu)于GCpF1和GCpF2，而其他組份活性均低于GCpF1和GCpF2。均一多糖GCpF1-1B和GCpF2-1B具有良好的刺激小鼠脾淋巴細胞增殖作用，呈現(xiàn)劑量依賴性，其中GCpF1-1B活性更好，而均一多糖GCpF2-3B雖然也表現(xiàn)出一定的刺

10、激小鼠脾淋巴細胞增殖作用，但活性顯著低于前兩種均一多糖;3種均一多糖與相應的DEAE陰離子柱組份相比活性均有一定提高。
　　龍須菜多糖在體外沒有表現(xiàn)出抑制L1210腫瘤細胞生長的作用。
　　抗氧化實驗表明，GCp、GCpF1和GCpF2對游離的超氧陰離子自由基、羥自由基和H2O2均有一定的清除作用，尤其是低濃度時，清除率與多糖濃度呈現(xiàn)一定的線性關系，但當濃度升高到一定程度繼續(xù)增加濃度，清除率不再升高。均一多糖GCpF2-1B

11、和GCpF2-3B對三種自由基的清除作用有所提高;并且樣品GCpF2-1B對三種活性氧的IC50均顯著低于GCpF2-3B，表明GCpF2-1B活性高于GCpF2-3B。
　　4、龍須菜均一多糖GCpF2-1B免疫調節(jié)作用研究
　　GCpF2-1B處理小鼠巨噬細胞株RAW264.7后，細胞體積彭大，并有偽足形成，表明其呈明顯活化狀態(tài);GCpF2-1B可刺激RAW264.7細胞釋放NO，還可刺激RAW264.7細胞增加1L-1