金銀花多酚氧化酶提取純化、酶學(xué)性質(zhì)及抑制效應(yīng)研究.pdf

1、金銀花為植物忍冬的花蕾，其在采收后不易存放需及時干燥，而長時間的放置和不恰當(dāng)?shù)母稍锿斐山疸y花外觀顏色劣變和藥用品質(zhì)的損失，前期研究結(jié)果證實(shí)，造成這一損失的主要原因是多酚氧化酶與酚類物質(zhì)發(fā)生的酶促褐變，在外觀顏色褐變的同時導(dǎo)致其活性成分綠原酸等含量的降低，影響其價(jià)值。本文以新鮮金銀花為研究對象，通過勻漿浸提、鹽析透析及柱層析，分離得到較純的金銀花多酚氧化酶；采用分光光度法和雙倒數(shù)作圖法對金銀花多酚氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)、理化性質(zhì)及其抑制劑進(jìn)

2、行了系統(tǒng)的研究。主要研究結(jié)果如下：
　　本文采用勻漿浸提法提取金銀花多酚氧化酶，經(jīng)單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得到金銀花多酚氧化酶的最佳提取工藝條件為：料液比1:6.3，緩沖液 pH8.03，PVPP添加量1g/100mL，提取時間1.71h，得到的PPO比活力為667.56U/mg；粗酶液經(jīng)40％飽和硫酸銨沉淀，Tris-HCl透析12h后，經(jīng)Sephadex G-100凝膠柱層析，而得到純化的金銀花多酚氧化酶，并通過 SDS-PAGE電

3、泳檢測其純度，其分子量約為43000D。
　　研究發(fā)現(xiàn)金銀花多酚氧化酶是一種耐堿、耐熱酶，最適作用底物為綠原酸，米氏常數(shù)Km為0.0059mol/L，最大反應(yīng)速率Vmax為4.5393OD/min，最適底物濃度為0.005mol/L，酶最適pH為9，在堿性環(huán)境中PPO活性較高，最適溫度為40℃，40-60℃之間酶活保留較好，金屬離子Fe2+，K+，Mg2+能夠促進(jìn)PPO活性的增大， Cu2+，Ba2+，Ca2+均對金銀花PPO具有

4、抑制作用，Zn2+，Mn2+對PPO活性具有雙重作用，濃度低時激發(fā)PPO活性，濃度高于一定時抑制其活性。
　　本文研究了抗壞血酸、4-己基間苯二酚、L-半胱氨酸、檸檬酸、丙酮對金銀花多酚氧化酶的抑制效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)它們均對金銀花多酚氧化酶有抑制作用，并隨其濃度的增加抑制作用增強(qiáng)，半抑制濃度分別為0.062，0.053，0.140，0.048mmol/L，5.55%。抗壞血酸、4-己基間苯二酚、L-半胱氨酸、丙酮對金銀花多酚氧化酶的抑制屬

5、于可逆抑制，檸檬酸為不可逆抑制。
　　通過雙倒數(shù)作圖分析得出抗壞血酸、4-己基間苯二酚、L-半胱氨酸、丙酮對金銀花多酚氧化酶抑制類型分別為混合性，競爭性，反競爭性，非競爭性。抗壞血酸對酶的抑制常數(shù)KI為1.620 mmol/L，對酶-底物絡(luò)合物抑制常數(shù)KIS為1.995mmol/L；4-己基間苯二酚對游離酶的抑制常數(shù)KI為4.587mmol/L,對酶-底物絡(luò)合物的抑制常數(shù)KIS為0；L-半胱氨酸對游離酶的抑制常數(shù)KI為0,對酶-底