β-葡聚糖酶菌種選育及發(fā)酵條件優(yōu)化研究.pdf

1、根據(jù)剛果紅與谷物β-葡聚糖緊密結(jié)合而顯示紅色的特征，采用“GCN平板法”和“改良瓊脂塊鑒定平板法”對本實驗室保存的多株菌種進行初步篩選和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，得到一株產(chǎn)酶活力高、發(fā)酵周期短的β-葡聚糖酶生產(chǎn)菌株-黑曲霉(Aspergillusniger)QYW-01。然后通過多次紫外誘變以及產(chǎn)酶馴化和篩選，獲得一株β-葡聚糖酶高產(chǎn)突變株黑曲霉QYW-01A06，經(jīng)過連續(xù)六次傳代并分別測定各代菌株的產(chǎn)酶性能，確定該菌株在產(chǎn)酶能力方面具有較好的穩(wěn)定

2、性。黑曲霉QYW-01A06經(jīng)搖瓶培養(yǎng)，發(fā)酵液酶活力可達125u/mL，是出發(fā)菌株QYW-01的2.6倍。 采用單因素實驗和正交實驗對黑曲霉QYW-01A06搖瓶分批發(fā)酵生產(chǎn)β-葡聚糖酶的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行了研究，得出其最佳培養(yǎng)基配方為(g/100mL)：大麥粉4.0，玉米漿1.0，(NH4)2SO40.3，NaNO30.2，F(xiàn)eSO47H2O0.01，MgSO40.02，CaCO30.5；最佳發(fā)酵產(chǎn)酶條件為：發(fā)酵初始pH值5

3、.5-6.0，發(fā)酵溫度31℃，裝液量為80mL/500mL三角瓶，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，接種量為2.0×105個孢子/mL發(fā)酵液，發(fā)酵周期為30小時。在最適產(chǎn)酶條件下進行搖瓶分批發(fā)酵，發(fā)酵液酶活力達318.4u/mL，是初始產(chǎn)酶條件的2.5倍。在搖瓶分批發(fā)酵的基礎(chǔ)上進行搖瓶分批補料發(fā)酵實驗，對補料材料、補料方式和補料時間進行了研究。結(jié)果表明在發(fā)酵28小時和30小時分兩次補加6％的淀粉溶液和氮源溶液產(chǎn)酶效果比較好，雖然周期延長到了36小

4、時，但是發(fā)酵液酶活力提高到了433.1u/mL，是分批發(fā)酵的1.36倍。 對10L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)酶條件進行了初步研究，通過在不同種子培養(yǎng)基中觀察菌種的生長速度、菌絲形態(tài)以及接種后的產(chǎn)酶情況，確定最佳種子培養(yǎng)基(g/100mL)：葡萄糖1.0，大麥粉2.0，玉米漿1.0，(NH4)2SO40.3，NaNO30.2，MgSO40.02，F(xiàn)eSO47H2O0.01，CaCO30.5；種子培養(yǎng)條件：初始pH值5.5，溫度31℃，80mL培

5、養(yǎng)基/500mL三角瓶，轉(zhuǎn)速200rpm；種齡16-20小時；大罐接種量10％(v/v)。結(jié)合搖瓶發(fā)酵條件確定了發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)β-葡聚糖酶的基本工藝，并對間歇補料和連續(xù)補料分批發(fā)酵工藝作了初步探討，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵中后期連續(xù)補加15％的淀粉溶液和復(fù)合氮源，發(fā)酵液酶活力可達385.2u/mL。 發(fā)酵液離心去除菌體后得到的粗酶液經(jīng)硫酸銨分段沉淀，然后依次經(jīng)SephadexG-25柱脫鹽、SephadexG-75柱和DEAE-纖維素柱線性洗