基于離子液體萃取分離蛋白質(zhì)的研究.pdf

1、本論文首先制備新型的離子液體微乳，采用液液萃取方法進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離純化;為了克服離子液體損耗大等缺點(diǎn)，又合成固載離子液體進(jìn)行生物樣品的固相萃取;然后基于吸附蛋白顯著猝滅固載離子液體熒光的現(xiàn)象，建立固相萃取-固體表面熒光測定血紅蛋白含量的方法;最后研究咪唑類離子液體與蛋白質(zhì)之間的相互作用，為離子液體分離富集蛋白質(zhì)研究提供理論依據(jù)。
　　采用水、2-乙基己基琥珀酸酯磺酸鈉(AOT)、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸制備離子液體包水反相微

2、乳。該微乳體系可實現(xiàn)血紅蛋白的選擇性萃取。500μL微乳(水、AOT、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸組成質(zhì)量比為6/50/5，AOT濃度為0.5 mol L-1)萃取等體積100μg mL-1、pH6.3血紅蛋白水溶液，萃取率為96％。隨后，采用6 mol L-1尿素作反萃劑，可快速反萃取73％血紅蛋白。微乳萃取相中的血紅蛋白有兩種分布位置:離子液體連續(xù)相和“水池”分散相。血紅蛋白與咪唑環(huán)的配位作用有利于血紅蛋白轉(zhuǎn)移至離子液體連續(xù)相;帶

3、正電荷的蛋白與帶負(fù)電荷的AOT之間的靜電引力是推動血紅蛋白分布在“水池”分散相的主要驅(qū)動力。
　　以聚氯乙烯樹脂和N-甲基咪唑為原料，甲苯為反應(yīng)溶劑制備了新型固載離子液1-聚氯乙烯基-3-甲基咪唑氯代鹽(NmimCl-PVC)，并通過紅外光譜、核磁共振氫譜等手段對其進(jìn)行表征。改變聚氯乙烯樹脂與N-甲基咪唑的配比，離子液體的接枝率由3.3％增加至15.1％。隨著接枝率的提高，材料對堿性蛋白的選擇性吸附能力增強(qiáng)，減弱了原料PVC對蛋白

4、質(zhì)的非特異性吸附。采用接枝率為15.1％的NmimCl-PVC萃取Tris-HCl緩沖溶液中的100μg mL-1堿性蛋白（溶菌酶、細(xì)胞色素C、牛血紅蛋白），萃取率分別為97％、98％和94％，然而酸性蛋白（轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白、免疫球蛋白）的吸附可忽略。磷酸緩沖溶液、碳酸緩沖溶液和SDS溶液可分別洗脫89％、87％和84％的溶菌酶、細(xì)胞色素C、牛血紅蛋白。吸附和洗脫過程中，血紅蛋白的活性未下降，說明該新型材料的生物相容性較高。應(yīng)用該

5、萃取分離方法可以實現(xiàn)人全血中血紅蛋白的分離。
　　研究固載離子液體NmimCl-PVC的熒光光譜性質(zhì)。由于咪唑環(huán)陽離子被聚氯乙烯鏈限制在固定空間，與自由態(tài)離子液體相比，NmimCl-PVC的最大激發(fā)波長和發(fā)射波長向長波方向移動。并且由于NmimCl-PVC上離子液體存在不同的解離形態(tài)，離子液體的發(fā)射波長隨著的激發(fā)波長變化而改變。隨著離子液體接枝率增加，NmimCl-PVC的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。吸附的血紅蛋白能明顯猝滅NmimCl-P

6、VC發(fā)射的熒光，猝滅類型為動態(tài)猝滅和能量轉(zhuǎn)移猝滅?；贜mimCl-PVC對蛋白的選擇性吸附和蛋白質(zhì)對NmimCl-PVC熒光猝滅程度的差異，建立了固相萃取-固體表面熒光方法用于血紅蛋白的含量測定。該方法的線性方程為F/F0=-0.0213C+0.989，R2=0.9948，線性范圍為0.3-26.2μg mg-1，檢出限為0.1μg mg-1，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.6％(7.2μg mg-1，n=11)。
　　研究三種咪唑類離

7、子液體與牛血清白蛋白的相互作用。紫外可見光譜表明:隨著咪唑類離子液體濃度的增加，牛血清白蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。230 nm激發(fā)波長下，離子液體較弱地猝滅牛血清白蛋白的內(nèi)源熒光(猝滅常數(shù)約為102 L mol-1)，強(qiáng)弱順序為BbimCl≈BmimCl＜BmimNO3。BbimCl、BmimCl動態(tài)猝滅BSA發(fā)射的熒光，BmimNO3-BSA體系為以動態(tài)猝滅為主的動態(tài)-靜態(tài)聯(lián)合猝滅。結(jié)合熱力學(xué)公式計算出不同溫度下IL-BSA體系的焓變、熵變