南海沉積物中酯酶基因克隆表達及酶學性質(zhì)研究.pdf

1、酯酶(Esterase，E.C.3.1.1.X)在廣義上指的是一類具有催化酯鍵水解或酯鍵形成的一類酶的總稱，廣泛存在于各種生態(tài)環(huán)境的動植物和微生物中。海洋具有各種低溫、高溫、高靜水壓、強酸、強堿以及營養(yǎng)條件極為貧乏的各種極端環(huán)境，因此從海洋特殊環(huán)境的微生物中篩選具有工業(yè)所需高效新型特性的酯酶具有廣泛的開發(fā)前景。
　　本研究從南海深海沉積物中分離得到元基因組DNA，并構建元基因組Fosmid文庫，篩選克隆獲得酯酶完整基因est424

2、，長度為921 bp，編碼307個氨基酸，在氨基酸水平上與已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的酯酶同源性低于85％，可能是一個新的酯酶。利用pET28系統(tǒng)構建酯酶重組表達載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導表達，但是重組酯酶形成包涵體，因此利用伴侶蛋白系統(tǒng)Chaperone Plasmid Set與酯酶重組表達載體進行共轉(zhuǎn)化，通過5種伴侶蛋白的優(yōu)化，利用分子伴侶蛋白dnaK-dnaJ-grpE共表達，最終獲得了可溶性的重組酯酶蛋白，約35 kDa。
　

3、　利用Ni+親和層析系統(tǒng)，對重組酯酶進行分離純化，獲得了單一的純化的重組酯酶est424。利用p-nitrophenol butyrat方法，研究重組酯酶的酶學性質(zhì)。酯酶est424最適反應溫度為35℃，最適反應pH值為8.0，該酯酶是一個中溫堿性酯酶，其酶活單位為171.03U/mg。它在20℃下穩(wěn)定，F(xiàn)e2+和Mn2+可以有效提高酶的活性，1％的Tween80和20也可以提高酯酶的活性。
　　從海洋微生物及海洋環(huán)境中來源的重組