pBSHH1質(zhì)粒載體介導(dǎo)CTGF shRNA抑制TGF-β-,1-誘導(dǎo)的人近端腎小管上皮細(xì)胞CTGF及ECM的表達(dá).pdf

1、在各種原因所致的慢性腎臟疾病中，腎小管間質(zhì)纖維化的程度與腎功能減退密切相關(guān)，它是衡量腎臟疾病慢性進(jìn)展的重要指標(biāo)之一，是腎臟疾病終末期的共同特征。因而盡早阻止甚至逆轉(zhuǎn)腎小管間質(zhì)纖維化，對(duì)防治終末期腎功能衰竭有重大意義。腎小管間質(zhì)纖維化的病理基礎(chǔ)為間質(zhì)內(nèi)大量基質(zhì)蛋白的積聚。腎小管上皮細(xì)胞是病理狀態(tài)下分泌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的腎間質(zhì)成肌纖維細(xì)胞的主要來(lái)源之一，其通過(guò)表型轉(zhuǎn)化、分泌細(xì)胞因子、影響細(xì)胞外基質(zhì)代謝等方式，參與腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生與

2、發(fā)展。 腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生機(jī)制尚未完全明確，但細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)始終是關(guān)注的焦點(diǎn)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β<,1>(Transforming growth factor-β<,1>，GTF-β<,1>)是致纖維化的重要細(xì)胞因子。新近的研究表明，TGF-β<,l>是通過(guò)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(Connectiv tissue growth factor，CTGF)促使細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)合成增加進(jìn)而促進(jìn)腎小管間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。作為TGF-β<,1

3、>的下游因子，CTGF被認(rèn)為是前纖維化的重要標(biāo)志，其促進(jìn)組織和器官纖維化的作用僅局限于結(jié)締組織，是腎小管間質(zhì)纖維化的中心環(huán)節(jié)。體內(nèi)外試驗(yàn)均已證實(shí)，在各種腎間質(zhì)疾病狀態(tài)下，CTGF的表達(dá)均明顯上調(diào)并與小管間質(zhì)纖維化的程度密切相關(guān)，故下調(diào)CTGF的表達(dá)有可能延緩甚至逆轉(zhuǎn)纖維化。據(jù)報(bào)道，CTGF反義寡核苷酸可顯著抑制腎小管上皮細(xì)胞TGF-β<,1>。誘導(dǎo)的纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)、纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)、膠原I

4、(Col I)等細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)。但因抑制效率不高、有效持續(xù)時(shí)間不長(zhǎng)、反義技術(shù)沒有放大效應(yīng)、用量一般較大而限制了其的臨床應(yīng)用。因此，我們?cè)谶M(jìn)一步探尋更有效的基因治療方法來(lái)下調(diào)病理狀態(tài)下腎小管上皮細(xì)胞CTGF的表達(dá)，以期延緩腎間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)的積聚。 近年來(lái)，作為2002年世界十大科學(xué)成就之首的RNA干擾(RNA int- erference，RNAi)越來(lái)越為人們所重視。RNAi是一種由雙鏈RNA介導(dǎo)同源序列mRNA的特異

5、降解而導(dǎo)致的基因沉默，是一門新興的轉(zhuǎn)錄水平上的基因阻斷技術(shù)，具有高度的序列專一性，能簡(jiǎn)單、高效地阻抑特定基因的表達(dá)，有望成為基因治療和基因功能分析的重要工具。鑒于體外合成的siRNA費(fèi)用高，持續(xù)作用不能保證。因此，先在體外構(gòu)建能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)發(fā)夾狀siRNA的載體，再將載體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出siRNA從而引發(fā)基因沉默。與pSUPER質(zhì)粒結(jié)構(gòu)相似的pBSHHl質(zhì)粒載體是由人RNAIII型聚合酶H1啟動(dòng)子構(gòu)建，其可通過(guò)模板設(shè)計(jì)使細(xì)胞

6、內(nèi)合成的RNA呈發(fā)夾狀從而延長(zhǎng)阻斷基因表達(dá)的時(shí)間。siRNA一般插入于RNA多聚酶Ⅲ(PolⅢ)啟動(dòng)子和4—5個(gè)T的轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)之間，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物終止于轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)的第二個(gè)堿基并折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，最后在體內(nèi)被加工成為大約21個(gè)堿基的類似siRNAs的分子，起始RNAi的進(jìn)程。據(jù)鑒于上述原理，我們構(gòu)建了由pBSHHl介導(dǎo)的能能在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生短發(fā)夾環(huán)狀CTGF siRNA的質(zhì)粒載體，并將此質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人近端腎小管上皮(HK-2)細(xì)胞株，觀

7、察其對(duì)TGF-β<,1>刺激下的HK-2細(xì)胞CTGF、FN表達(dá)的抑制作用。 本博士學(xué)位論文分為三部分：第一部分為構(gòu)建四個(gè)能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)CTGF shRNA的pBSHH1質(zhì)粒載體和一陰性對(duì)照質(zhì)粒。第二部分將已構(gòu)建的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞，觀察CTGF shRNA的四個(gè)質(zhì)粒對(duì)TGF-β<,1>刺激下的HK-2細(xì)胞表達(dá)CTGF的影響，篩選出CTGF基因的最佳siRNA序列。第三部分將篩選出的CTGF siRNA轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞，進(jìn)一

8、步觀察其對(duì)TGF-β<,1>刺激下的HK-2細(xì)胞FN表達(dá)的影響，為RNAi治療腎小管間質(zhì)纖維化提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究主要的目的、方法、結(jié)果和結(jié)論概述如下： 目的：構(gòu)建能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)CTGF shRNA的pBSHHI質(zhì)粒載體。研究pBSHHl質(zhì)粒載體介導(dǎo)的CTGF shRNA對(duì)TGF-β<,1>誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞CTGF及FN表達(dá)的影響，為獲得CTGF基因的最佳siRNA序列和RNAi治療腎小管間質(zhì)纖維化提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法

9、：構(gòu)建能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)CTGF shRNA的pBSHHl質(zhì)粒載體。首先從CTGF基因中篩選出4個(gè)符合RNAi條件的片段并設(shè)一陰性對(duì)照，分別設(shè)計(jì)5對(duì)寡核苷酸，退火后形成雙鏈，兩端帶有BgⅠⅡ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，將上述五對(duì)寡核苷酸依次連入BgⅠⅡ和HindⅢ雙酶切后線形化的pBSHHl載體，構(gòu)建成能在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生CTGF shRNA的質(zhì)粒載體pBSHHl-CTGF-siRNA-1，2，3，4和一陰性對(duì)照質(zhì)粒，依次命名為pBSHHl-T-1，2

10、，3，4，C，然后采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞。逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse Transcription-PCR，RT-PCR)半定量分析HK-2細(xì)胞中CTGF、FN mRNA的表達(dá)。Western blot方法檢測(cè)HK-2細(xì)胞中CTGF蛋白質(zhì)水平。ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中FN蛋白質(zhì)水平。 結(jié)果：pBSHHl-T-1，2，3，4，C質(zhì)粒載體通過(guò)酶切鑒定、測(cè)序證實(shí)，重組質(zhì)粒連接正確且無(wú)突變。HK-2細(xì)胞表達(dá)少量

11、CTGF和FN;TGF-β<,1>刺激后，CTGF、FN的表達(dá)較陰性對(duì)照組明顯上調(diào)(P<0.01)：4種含不同CTGF特異性序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，pBSHHl-T-3，4能抑制ETGF、FN在HK-2細(xì)胞中的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，與空載體轉(zhuǎn)染組相比有顯著性差異(P<0.01)。 結(jié)論：HK-2細(xì)胞表達(dá)少量CTGF、FN；TGF-β<,1>刺激HK-2細(xì)胞后CTGF、FN的表達(dá)明顯上調(diào)；pBSHHl-T-3，4質(zhì)粒載體能夠顯著抑制T