紅色熒光蛋白標(biāo)記的淋巴瘤白血病小鼠的構(gòu)建.pdf

1、目的:通過構(gòu)建含有紅色熒光蛋白(DsRed)和新霉素耐藥基因(neo)基因的慢病毒載體并感染小鼠淋巴瘤EL4細(xì)胞,建立DsRed標(biāo)記的淋巴瘤白血病小鼠。
　　 方法:構(gòu)建含DsRed、neo及內(nèi)部核糖體進入位點序列(IRES)的雙順反子自身失活型慢病毒載體。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將慢病毒三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞系293FT包裝細(xì)胞,收集病毒上清,感染EL4細(xì)胞,利用G418的藥物選擇特性篩選感染細(xì)胞獲得穩(wěn)定表達(dá)DsRed的EL4

2、細(xì)胞株,通過熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)鑒定其DsRed的表達(dá)。將不同數(shù)量攜帶有DsRed的EL4細(xì)胞(5×102、5×103、2.5×104)經(jīng)尾靜脈注入經(jīng)7.0 Gy清髓照射的C57BL/6小鼠體內(nèi),同時接種C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞,構(gòu)建紅色熒光蛋白標(biāo)記的淋巴瘤白血病小鼠。通過外周血白細(xì)胞計數(shù)、血涂片、FCM、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、組織病理檢查及熒光顯微鏡檢查鑒定小鼠成模情況。
　　 結(jié)果:成功構(gòu)建了慢病

3、毒表達(dá)載體pXZ208-neo-IRES-DsRed。包裝病毒后感染EL4細(xì)胞,經(jīng)G418篩選的EL4細(xì)胞傳代培養(yǎng)1個月后,DsRed+細(xì)胞的比例仍在95％以上,與未感染的EL4細(xì)胞相比較,其生物學(xué)特性未改變。C57BL/6小鼠接種不同數(shù)量攜帶DsRed的EL4細(xì)胞后發(fā)病率達(dá)100％,FCM檢測受鼠各組織中DsRed+細(xì)胞明顯增高,且肝臟＞脾臟＞骨髓＞外周血;組織病理學(xué)檢查呈現(xiàn)出不同程度的腫瘤細(xì)胞浸潤,同時在熒光顯微鏡下可觀察到較明顯的

4、紅色熒光細(xì)胞浸潤;在白血病發(fā)病早期RT-PCR即可檢測到neo的表達(dá)。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建了含有DsRed基因、neo基因的慢病毒表達(dá)載體pXZ208-neo-IRES-DsRed,命名為pXZ10。該慢病毒載體能有效的感染EL4細(xì)胞,穩(wěn)定、高效、持久地表達(dá)DsRed,與未感染的EL4細(xì)胞相比較,其生物學(xué)特性無改變。感染后的EL4細(xì)胞命名為ELA/DsRed細(xì)胞。C57BL/6小鼠經(jīng)清髓照射后尾靜脈輸注最低細(xì)胞數(shù)量為5×102