膿毒癥心肌線粒體損傷的動物實驗研究.pdf

1、背景：
　　 膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征（Systemic inflammatory response syndrome，SIRS），進一步發(fā)展可引起嚴重膿毒癥（severe sepsis）、膿毒癥休克(septic shock)和多器官功能障礙綜合征(MODS)。膿毒癥本質(zhì)上是一種機體自身免疫性損傷，其發(fā)病率高、病情復(fù)雜，是PICU患兒主要死亡原因之一。近年來，越來越多的報道指出：膿毒癥時存在線粒體損傷，但其具體的

2、機制尚不十分明確。心臟是膿毒癥的易損靶器官之一，臨床觀察可以發(fā)現(xiàn)部分膿毒癥患者會出現(xiàn)心功能不全，甚至心衰。目前，有關(guān)膿毒癥時心肌線粒體功能和形態(tài)學(xué)變化情況的研究較少，心肌線粒體損傷的機制尚不十分明確。
　　 目的：
　　 本課題通過研究膿毒癥時心肌損傷指標變化、心肌病理組織學(xué)改變、心肌線粒體形態(tài)及功能變化、心肌線粒體氧化應(yīng)激和氮化應(yīng)激狀況，研究膿毒癥心肌受損及其線粒體損傷規(guī)律，探索膿毒癥心肌線粒體損傷的可能機制，為臨床認

3、識和治療膿毒癥心功能障礙提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1．建立動物模型及分組50只SPF級SD大鼠隨機分為正常對照組、4小時膿毒癥組(4hLPS)、24小時膿毒癥組（24hLPS）、48小時膿毒癥組（48hLPS）和72小時膿毒癥組（72hLPS），每組10只。膿毒癥組腹腔注射10 mg/kg內(nèi)毒素(LPS)建立膿毒癥大鼠模型，正常對照組腹腔注射等體積生理鹽水。
　　 2.指標檢測及方法觀察每組大

4、鼠一般情況：包括肛溫、心率和呼吸頻率，測定血漿LPS水平。各組大鼠在相應(yīng)時間點處死，采集血液和心肌組織標本。全自動生化分析儀檢測血清CK、CK-MB和cTnI水平。光鏡觀察大鼠心肌組織病理改變。電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)變化，按Flameng分級方法對心肌線粒體進行半定量評分。差速離心法提取心肌線粒體，流式細胞儀檢測心肌線粒體腫脹度及線粒體膜電位，檢測線粒體Ca2+-Mg2+ATP酶活性，測定線粒體呼吸鏈complexI、II、III、IV活

5、性，測定線粒體超氧化物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、過氧化氫酶（CAT）、一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.大鼠一般情況觀察LPS組大鼠血漿LPS均為陽性。所有LPS組大鼠均出現(xiàn)心率、呼吸顯著加快、體溫上升、嗜睡等內(nèi)毒素血癥狀態(tài)。
　　 2.心肌損傷評估心肌損傷標志物：與對照組相比，24hLPS組、48hLPS組、72hLPS組血清cTnI水平明顯

6、升高 (P<0.01)；從4hLPS開始血清cTnI水平一直呈上升趨勢。與對照組相比，4hLPS組、24hLPS組、72hLPS組血清CK水平明顯升高 (P<0.01，P<0.01，P<0.05)。與對照組相比，4hLPS組、24hLPS組、72hLPS組血清CK-MB水平明顯升高 (P<0.01，P<0.01，P<0.05)。光鏡觀察發(fā)現(xiàn)對照組心肌無異常結(jié)構(gòu)改變，LPS各組心肌組織以炎癥反應(yīng)變化為主，可見心肌細胞變性、局灶性壞死，這種

7、變化在4h已經(jīng)出現(xiàn)，至72h無明顯緩解。
　　 3．心肌線粒體損傷
　　 ⑴心肌線粒體形態(tài)學(xué)改變：
　　 電鏡下可見心肌線粒體腫脹、基質(zhì)密度降低，心肌纖維斷裂、溶解；心肌線粒體形態(tài)學(xué)改變高峰為24h和72h。與對照組相比，72hLPS組心肌線粒體半定量評分明顯升高 (P<0.01)。與對照組相比，4hLPS組、72hLPS組線粒體腫脹度較明顯升高(P<0.01)。
　　 ⑵心肌線粒體功能改變:
　　

8、 各組間心肌線粒體膜電位的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 與對照組相比，24hLPS組、48hLPS組、72hLPS組心肌線粒體Ca2+-Mg2+ATP酶活性明顯降低(P<0.01)。與4hLPS組相比，24LPS組、48 LPS組、72LPS組心肌線粒體Ca2+-Mg2+ATP酶活性明顯降低 (P<0.01)。
　　 與對照組相比，4hLPS組、24hLPS組、48hLPS組、72hLPS組心肌線粒體c

9、omplex I活性明顯降低(P<0.01)。與4hLPS組相比，24 LPS組、48 LPS組、72 LPS組心肌線粒體complex I活性明顯降低(P<0.01)。與對照組相比，4hLPS組、24hLPS組、48hLPS組、72hLPS組心肌線粒體complex III 活性明顯降低 (P<0.01)。心肌線粒體complex I、complex III活性自4h開始下降，至72h 沒有明顯恢復(fù)。各組間心肌線粒體complex I

10、I、complex IV活性的差異不具有統(tǒng)計學(xué)差異(P ＞0.05)。
　　 4.心肌線粒體內(nèi)源性氧化應(yīng)激相關(guān)因子與對照組相比，LPS組心肌線粒體SOD活性無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。與4hLPS相比，48hLPS組心肌線粒體SOD活性明顯升高(P<0.05)。
　　 與對照組相比，48hLPS組和72hLPS組心肌線粒體MDA含量明顯升高(P<0.05)。
　　 與對照組相比，LPS組心肌線粒體GSH活性無統(tǒng)

11、計學(xué)差異(P＞0.05)。與24hLPS組相比，72hLPS組心肌線粒體GSH活性明顯下降(P<0.05)。
　　 與對照組相比，24hLPS組、48hLPS組、72hLPS組心肌線粒體iNOS活性明顯升高(P<0.01，P<0.01，P<0.05)。與4hLPS相比，24hLPS組、48hLPS組、72hLPS組心肌線粒體iNOS活性明顯升高(P<0.01，P<0.01，P<0.05)。
　　 各組間CAT活性、NO含

12、量的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 5.相關(guān)性分析 心肌線粒體MDA含量、iNOS活性與線粒體呼吸鏈complexI活性存在明顯負相關(guān)性(r=-0.450，P<0.05; r=-0.613，P<0.01)。心肌線粒體iNOS活性與線粒體呼吸鏈complex III活性存在明顯負相關(guān)性(r=-0.462，P<0.05)。血清肌鈣蛋白水平與心肌線粒體呼吸鏈complex I活性存在明顯負相關(guān)性(r=-0.570，P<0