露地菊耐低溫特性研究及遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建.pdf

1、露地菊（Dendranthema×gandiflorum）是重要的園林綠化花卉之一，具有植株低矮，開花繁密，耐粗放管理等特性，有一定的社會經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但是其盛花期通常處于深秋季節(jié)，往往因溫度驟降導(dǎo)致觀賞價(jià)值降低。通過遺傳轉(zhuǎn)化途徑引入重要的抗逆基因，有望提高菊花抵御低溫的能力。本研究以11個(gè)北方主要栽培露地菊品種（‘金不換’、‘矮紅’、‘蜂窩粉’、‘雪濤’、‘秋艷’、‘粉玫瑰’、‘紫秋裳’、‘富麗’、‘金鳳凰’、‘東林瑞雪’、‘袖珍紅’）和

2、以這些品系為母本，在雜交子代中選育的16個(gè)綜合性狀優(yōu)良的露地菊品系（‘東林1號’、‘東林2號’、‘東林3號’、‘東林4號’、‘東林5號’、‘東林6號’、‘東林7號’、‘東林8號’、‘東林9號’、‘東林10號’、‘東林11號’、‘東林12號’、‘東林13號’、‘東林14號’、‘東林15號’、‘東林16號’）為試材，在對這27個(gè)露地菊品種和品系耐低溫能力篩選的基礎(chǔ)上，選擇其中耐寒能力較強(qiáng)的4個(gè)露地菊品系和品種，進(jìn)行了以葉片為外植體直接誘導(dǎo)不

3、定芽的研究。同時(shí)從擬南芥中克隆了AtproDH和P5CS基因，并應(yīng)用Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建了植物表達(dá)載體，進(jìn)行P5CS基因轉(zhuǎn)化露地菊的研究。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　1、露地菊抗凍品種和品系的篩選
　　利用受傷率和傷害指數(shù)兩項(xiàng)指標(biāo)對27個(gè)露地菊品系進(jìn)行耐低溫篩選，篩選出‘金不換’、‘雪濤’、‘富麗’、‘東林4號’、‘東林6號’、‘東林9號’、‘東林13號’等7個(gè)耐低溫品系，同時(shí)發(fā)現(xiàn)‘粉玫瑰’、‘東林1號’、‘東

4、林2號’三個(gè)品系的耐低溫能力最差;
　　通過對不同自然低溫處理時(shí)期，7個(gè)品系的電導(dǎo)率、丙二醛含量、脯氨酸含量、過氧化氫酶、果糖、葡萄糖和可溶性糖等指標(biāo)的測定發(fā)現(xiàn)，‘雪濤’和‘東林4號’的耐低溫能力要強(qiáng)于其它品系，尤其是‘東林4號’對低溫的調(diào)節(jié)能力較強(qiáng)，在低溫脅迫下，能夠調(diào)節(jié)滲透途徑減輕低溫的傷害。
　　2、低溫脅迫下，露地菊蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析
　　利用二維液相色譜技術(shù)，分離了‘東林4號’露地菊品系的低溫處理和對照樣品的總

5、蛋白，通過ProteoVue軟件分析發(fā)現(xiàn):處理樣品與對照相比共有蛋白差異點(diǎn)36個(gè)，其中顯著增強(qiáng)表達(dá)的蛋白差異點(diǎn)有26個(gè)。選取10個(gè)差異色譜峰，經(jīng)過蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定了3個(gè)植物耐低溫相關(guān)蛋白質(zhì)，分別是:假定的鈣離子運(yùn)輸ATP酶，鐵氧還-硫氧還蛋白還原酶，假定的細(xì)胞色素C氧化酶。
　　3、抗凍基因的克隆及植物表達(dá)載體的構(gòu)建
　　通過RT-PCR方法從擬南芥中克隆了P5CS和AtproDH的cDNA全長基因。利用Gateway克隆技術(shù)

6、分別構(gòu)建了AtproDH和P5CS兩個(gè)基因的植物表達(dá)載體。
　　4、露地菊遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立
　　建立‘東林4號’、‘東林6號’、‘東林9號’葉片外植體再生體系，發(fā)現(xiàn)不同基因型葉片外植體的分化率差異明顯?！畺|林9號’的葉片外植體分化率最高?！畺|林13號’未獲得以葉片為外植體的不定芽。‘東林4號’最適分化培養(yǎng)基為:MS+3 mg/L BA+0.1mg/L2，4-D，葉片分化率為10％;‘東林6號’最適分化培養(yǎng)基為:MS+2 m

7、g/L BA+1 mg/LNAA，葉片分化率為82％;‘東林9號’最適分化培養(yǎng)基為:MS+0.5 mg/L BA+1.5 mg/L NAA，該品系植株上層幼嫩葉片分化率為95％，中下層葉片分化率均小于50％;
　　潮霉素對以葉片為外植體的分化起到很強(qiáng)的抑制作用，在潮霉素含量為5 mg/L的培養(yǎng)基中葉片即可失去分化能力?！畺|林9號’品系組培再生芽在含有30 mg/L潮霉素的培養(yǎng)基中全部死亡。
　　通過農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)，