秈稻高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、水稻是世界上最重要的糧食作物之一，世界上約40％人口的主要食糧是水稻，同時(shí)水稻也是單子葉植物基因組學(xué)遺傳和功能組學(xué)研究的模式植物，在我國(guó)地位僅次于小麥。近年來，遺傳轉(zhuǎn)化在水稻品種改良、基因功能檢測(cè)、創(chuàng)造突變體中發(fā)揮著越來越重要的作用，隨著分子生物學(xué)研究的深入，基因的分離、克隆和重組技術(shù)以及轉(zhuǎn)基因的日趨成熟，遺傳轉(zhuǎn)化已成為水稻遺傳改良的一種有效手段。 水稻的遺傳轉(zhuǎn)化中最常用的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是模仿天然的載體

2、轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，和其它轉(zhuǎn)化方法相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，而使其廣泛應(yīng)用于水稻研究中。然而，水稻品種間遺傳差異性很大且對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的基因依賴性強(qiáng)，從而增大了遺傳轉(zhuǎn)化的復(fù)雜性和隨機(jī)性。尤其是對(duì)于秈稻品種，仍存在著較大的困難，雖然國(guó)內(nèi)外報(bào)到了一些秈稻轉(zhuǎn)化成功的例子，但是轉(zhuǎn)化率卻非常低，而且僅限于特定的品種，還未能找到適合于所有秈稻品種轉(zhuǎn)化的通用轉(zhuǎn)化平臺(tái)。因此，要建立高效穩(wěn)定的秈稻遺傳轉(zhuǎn)化體系仍有許多問題需要研究，而且在絕大多數(shù)南方地區(qū)栽培品

3、種主要為秈稻，因此，遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)對(duì)秈稻進(jìn)行改良具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。 本研究主要進(jìn)行了如下工作： 1、分析了影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻的主要因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：菌液濃度OD值為0.3-0.5之間最有利于感染，并且在感染時(shí)附加振蕩，效果更佳；在菌液和培養(yǎng)基中都不添加AS，反而提高了轉(zhuǎn)化率；加入維生素C對(duì)防止愈傷褐化有很好的作用；對(duì)洗菌后的愈傷進(jìn)行充分干燥、改變培養(yǎng)基中的碳源、提高分化培養(yǎng)基中瓊脂的濃度等等方法，從而得出一套改良后的轉(zhuǎn)化體

4、系。 2、對(duì)所獲得的抗性愈傷轉(zhuǎn)和轉(zhuǎn)基因植株分別隨機(jī)進(jìn)行抽樣檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因植株中和抗性愈傷中：抗hpt的概率分別在85％和90％左右；抗gus的概率分別在92％和96％左右。 3將優(yōu)化后的體系與原有的體系相比較，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化率由原來14.4％提高到26.4％。然后將含有同一種質(zhì)粒的三種不同農(nóng)桿菌AGL1，EHA105和LBA4404分別用改良前和改良后的轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EHA105的轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到了25％，其