桑樹高頻再生體系建立與遺傳轉(zhuǎn)化體系研究.pdf

1、桑樹(Morus alba Linn．)屬多年生雙子葉木本植物，其葉片是家蠶(BombyxmoriL．)的主要天然飼料，人們以獲取桑葉為主要栽培目的。同時(shí)，桑樹也是我國(guó)傳統(tǒng)的藥用植物。因此，桑樹是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)樹種，也是蠶絲業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。 木本植物的遺傳轉(zhuǎn)化遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于大田作物和其他草本植物，其中一個(gè)重要原因是木本植物組織培養(yǎng)和植株再生的難度較大，缺乏合適的轉(zhuǎn)化受體材料，難以建立高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，其次是基因型依

2、賴性較強(qiáng)，轉(zhuǎn)化效率不高。在前人工作的基礎(chǔ)上，本研究以農(nóng)桑14號(hào)(簡(jiǎn)稱農(nóng)14)、育71-1、陜305和大10四個(gè)桑品種冬芽為材料，建立了桑樹高效再生體系并對(duì)其遺傳轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)將β-葡聚糖苷酶(GUS)基因轉(zhuǎn)入桑樹對(duì)該體系進(jìn)行了檢測(cè)，為桑樹的遺傳轉(zhuǎn)化提供參考。主要研究結(jié)果如下。 1本文探討了植物激素6-BA、NAA、2,4-D、瓊脂、稀土元素鑭以及桑品種對(duì)桑樹冬芽分化的影響，篩選出了適于桑樹冬芽分化的最佳培養(yǎng)基為MS+6

3、-BA 1.2 mg/L+2,4-D 0.2 mg/L+LaCl<,3> 40 mg/L，不同桑品種對(duì)桑冬芽分化無(wú)顯著性影響。 2采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)影響桑樹離體葉片再生的因素：植物激素TDZ、NAA、6-BA、IAA及桑品種、苗齡、葉位等進(jìn)行了研究，獲得了葉片愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為：MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L；不定芽分化培養(yǎng)基：MS+6-BA 3.0 mg/L+IAA0.1 mg/L，以選用苗齡為

4、15 d的陜305試管苗葉片，其愈傷誘導(dǎo)率最高達(dá)93.9％，不定芽分化率為98.33％，由此建立了桑樹高頻再生體系。 對(duì)TDZ作用機(jī)理初步探討結(jié)果表明，TDZ可抑制葉片的脂質(zhì)過(guò)氧化作用，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，阻止葉片葉綠素的降解，抑制POD的活性，延緩離體葉片的衰老，提高了桑樹離體葉片的再生效率。 3本試驗(yàn)在上述建立的桑樹高頻再生體系基礎(chǔ)上，通過(guò)石蠟切片觀察了葉片愈傷再生來(lái)源。結(jié)果表明：愈傷組織的表皮由一層排列整齊、形

5、狀較小的細(xì)胞組成。皮層由大小不等的薄壁細(xì)胞組成，排列很不整齊，不定芽發(fā)生是從愈傷組織表皮和表皮下的細(xì)胞分生組織化發(fā)育而成，它是由表皮和表皮下一團(tuán)細(xì)胞核較大的小細(xì)胞組成，表明桑樹葉片愈傷組織誘導(dǎo)的不定芽有被轉(zhuǎn)化的可能。 4 由于桑樹屬于木本植物，其遺傳轉(zhuǎn)化存在一定難度和特殊性。通過(guò)對(duì)影響轉(zhuǎn)化效果的因子：菌液濃度(OD<,600>)、菌液浸染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、選擇培養(yǎng)基中Kan選擇壓和Cef抑菌濃度等進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明當(dāng)菌液OD600值為