花生高頻率植株再生體系的建立及其遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、花生(ArachishypogaeaL.）是我國重要的油料作物和經(jīng)濟作物之一，但由于花生遺傳基礎狹窄、抗逆性差，易感多種病蟲害，尤其是褐斑病、黑斑病、網(wǎng)紋斑病和黃曲霉病等真菌性病害，嚴重影響其產(chǎn)量和質(zhì)量。本論文以廣譜抗真菌性的β-1，3-葡聚糖酶基因（BG2）和幾丁質(zhì)酶基因(CH5B)為目的基因進行了花生遺傳轉(zhuǎn)化研究,旨在為培育抗病花生新種質(zhì)奠定基礎。首先以花生胚小葉為外植體,建立了高頻率植株再生體系;以此體系為培養(yǎng)基礎對農(nóng)桿菌介導的遺

2、傳轉(zhuǎn)化條件進行了研究,并獲得了轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果如下:
　　 1.以花生品種花育22和魯花11成熟種子的胚小葉為外植體，對不定芽誘導和體細胞胚胎發(fā)生及其植株再生條件進行了研究。結(jié)果表明:(1)不定芽誘導及植株再生試驗中，MSB5+1mg/LNAA+6mg/LBAP最有利于不定芽的誘導，花育22和魯花11不定芽誘導率分別達到95.0％和93.9％;當轉(zhuǎn)移到MSB5+4.0mg/LBAP培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能促使芽伸長，并獲得了較高頻率的植

3、株再生。(2)體細胞胚胎發(fā)生及植株再生試驗中，花育22和魯花11在添加10mg/L2,4-D培養(yǎng)基上體細胞胚誘導率均最高，分別為83.6％和86.6％;MSB5+5μg/LTDZ較有利于促進體細胞胚萌發(fā)和植株再生。(3)在添加0.5mg/LNAA的MSB5培養(yǎng)基上，花育22的生根率為67.2％，魯花11為80.6％。
　　 2為解決花生組培再生苗及轉(zhuǎn)基因苗馴化移栽成活率低的難題，本試驗以花生實生苗作為砧木，對花生嫁接技術(shù)進行了研

4、究。試驗結(jié)果表明:超凈臺內(nèi)無菌嫁接效果較好，以再生苗或?qū)嵣鐬榻铀脒M行無菌嫁接，其成活率均達90％以上，明顯高于室內(nèi)嫁接成活率(71％-72％);無菌嫁接時12-15d苗齡的砧木效果最好;將無菌嫁接苗在培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-5d，然后馴化1-2d，移栽成活率最高，不同花生基因型成活率在83％-95％;嫁接苗移栽田間后，其成活率高達94％，且100％接穗結(jié)果。
　　 3.以花育23和白沙1016幼葉為受體材料，對器官發(fā)生途徑的花生遺傳轉(zhuǎn)

5、化條件進行了優(yōu)化。農(nóng)桿菌菌株為GV3101，質(zhì)粒為雙元表達載體pCH5B1300，以潮霉素(HB)作為抗性篩選標記，T-DNA區(qū)有CH5B基因。首先進行了HB濃度(10，15，20，25，30mg/L)篩選的試驗，結(jié)果確定HB篩選壓為20mg/L。研究了在農(nóng)桿菌懸浮液和共培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的乙酰丁香酮（AS:0，50，100，150μM）對抗性芽誘導的影響。結(jié)果表明，分別在農(nóng)桿菌侵染和共培養(yǎng)過程中添加100μMAS抗性芽誘導率最高

6、，有利于提高遺傳轉(zhuǎn)化效率。將抗性芽轉(zhuǎn)移到MSB5+4.0mg/LBAP+20mg/LHB+500mg/LCb的培養(yǎng)基上，促使芽伸長，長成小苗。
　　 4.以花育22胚小葉為受體材料，對體胚發(fā)生途徑的花生遺傳轉(zhuǎn)化條件進行了研究。農(nóng)桿菌菌株為EHA105，質(zhì)粒為雙元表達載體pATC940，T-DNA區(qū)含有BG2基因，以Km作為抗性篩選標記。對適宜的Km濃度進行了篩選試驗(設計0，10，20，25，30，40，50，75mg/L)，最

7、終確定Km篩選壓為50mg/L。研究了不同預培養(yǎng)時間(2，4，6d)、侵染時間(10，15，20min)、共培養(yǎng)時間(2，4，6d)對遺傳轉(zhuǎn)化的影響。結(jié)果表明，外植體預培養(yǎng)4d，在農(nóng)桿菌中侵染15min，共培養(yǎng)4d,然后轉(zhuǎn)移到MSB5+10mg/L2，4-D+50mg/LKm+500mg/LCb的體胚誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)，抗性體胚誘導率最高，為適宜的遺傳轉(zhuǎn)化條件。
　　 5.將抗性芽和抗性體胚轉(zhuǎn)移到相應的伸長和萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，促使