產(chǎn)黃酮銀杏內(nèi)生菌的分離、鑒定與發(fā)酵條件優(yōu)化研究.pdf

1、植物內(nèi)生菌(endophyte)是一類生活于植物組織內(nèi)部的微生物，包括細(xì)菌、真菌以及放線菌，其生活史的部分或全部階段在活的植物組織內(nèi)，但是并不會對植物組織造成明顯病害危害?！皟?nèi)共生理論”已經(jīng)表明，植物內(nèi)生菌在與宿主植物共生的過程中，能夠與宿主植物協(xié)同進(jìn)化，獲得植物部分功能基因，從而具有產(chǎn)生與宿主植物相同或相似代謝產(chǎn)物的能力。許多藥用植物內(nèi)生菌都能產(chǎn)生有一定活性代謝產(chǎn)物，近些年來，隨著對植物內(nèi)生菌研究的深入，已經(jīng)成為尋找新藥物來源的一種全

2、新的途經(jīng)。
　　本文以古老的孑遺植物銀杏(Ginkgo biloba L.)作為實驗材料，采用組織塊培養(yǎng)法分離銀杏根、莖和葉不同組織的內(nèi)生菌（包括真菌和細(xì)菌），利用75％酒精和3％次氯酸鈉結(jié)合的方法進(jìn)行樣品表面消毒，以保證所分離到的微生物是銀杏的內(nèi)生微生物。試驗結(jié)果表明，次氯酸鈉對銀杏根、莖和葉的消毒時間分別為5min、3min和1min時，消毒效果最好。在此條件下，從銀杏根、莖和葉共計分離到內(nèi)生菌664株，其中內(nèi)生真菌217株，

3、內(nèi)生細(xì)菌447株。真菌采用形態(tài)學(xué)初步進(jìn)行鑒定，分屬于5綱、10目、11科、13屬，能鑒定到屬的真菌主要有鐮刀菌屬（Fusarium）、棒孢屬（Corynespora）、鏈格孢屬（Alternaria）、腐皮鐮孢屬（Fusariumsolani）、匍柄霉屬（Stemphylium）、擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis）、叢赤殼菌屬（Nectria）、假尾孢菌屬（Pseudocercospora）、尾孢屬（Cercospora）、球座菌屬（Gu

4、ignardia）、毛霉屬（Mucor）、腐皮殼屬（Diaporthe）、腐霉屬（Pythium）;內(nèi)生細(xì)菌利用分子生物學(xué)方法擴(kuò)增其16SrDNA，鑒定分屬于5綱、8目、10科、18屬，鑒定到屬的細(xì)菌有假單胞菌屬（Pseudomonas）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、短波單胞菌(Brevundimonas)、葉桿菌屬（Phyllobacterium）、泛菌屬(Pantoea)、勒克氏菌屬(Leclercia)、短小桿

5、菌屬(Curtobacterium)、克呂沃爾菌屬（Kluyvera）、沙雷氏菌屬(Serratia)、黃單胞菌屬（Xanthomonas）、嗜冷菌屬（Psychrobacter）、新鞘脂菌屬(Novosphingobium)、募養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、紅球菌屬（Rhodococcus）、短桿菌屬(Brevibacterium)、棒狀桿菌屬（Microbacterium）和

6、芽孢桿菌屬（Bacillus）。
　　本文采用化學(xué)顯色法、薄層層析法(TLC)、高效液相色譜(HPLC)法，從根組織的內(nèi)生菌中篩選到2株產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的真菌GF111和GF5211。紫外分光光度法測定發(fā)酵液總黃酮產(chǎn)量分別為14.50±1.30 mg/L和21.10±1.30 mg/L;根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合真菌rDNA的居間序列（internal transcribed spacer，ITS）的系統(tǒng)進(jìn)化分析初步鑒定GF111和G

7、F521分別為卷枝毛霉（Mucor circinelloides）和尖鐮孢菌（Fusarium oxysporum）。
　　另外，本文針對總黃酮產(chǎn)量較高的菌株GF521，采用單因素試驗的方法對其培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，利用正交試驗進(jìn)行了培養(yǎng)條件的優(yōu)化。優(yōu)化表明，菌株GF521以麥芽糖作為碳源最佳、酵母粉作為氮源最佳、硫酸亞鐵作為無機(jī)鹽最佳;培養(yǎng)溫度(A)、裝液量(B)、搖床轉(zhuǎn)速(C)、接種量(D)和初始pH(E)五種因素對菌株GF521