豬流行性腹瀉病毒COE基因乳酸菌表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)研究.pdf

1、豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由冠狀病毒科、冠狀病毒屬的豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起，豬的一種以腹瀉、嘔吐和脫水為主要臨床特征的高度接觸性傳染病。PED給世界各國養(yǎng)豬業(yè)均帶來極大的危害，目前主要采用滅活或弱毒疫苗預(yù)防本病，但免疫保護(hù)效果不理想，因此，開展PED的基因工程疫苗研究有廣闊應(yīng)用前景。PEDV S糖蛋白是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生

2、中和抗體和提供免疫保護(hù)作用的主要結(jié)構(gòu)蛋白。PEDV的部分保護(hù)性抗原基因(即COE基因)編碼的部分S糖蛋白具有抗原性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。 實(shí)踐證明，血清IgG、IgM對PED的免疫保護(hù)效果不理想，腸道黏膜免疫所產(chǎn)生的分泌型抗體(sIgA)是抵抗PEDV感染的有效抗體。因此，選擇安全無毒，能夠在腸道中存活并能表達(dá)和傳遞抗原物質(zhì)的載體系統(tǒng)，有效地刺激黏膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生黏膜免疫應(yīng)答對本病的防治具有重要意義。本試驗(yàn)選擇乳酸乳球菌N2

3、3900作為受體菌表達(dá)外源基因COE，以期獲得PEDV口服活菌疫苗，依靠乳酸菌天然的抗菌、抗腹瀉作用和S蛋白刺激的特異性黏膜免疫作用，達(dá)到預(yù)防PED的目的。乳酸乳球菌N23900缺失乳糖操縱基因(lacF基因)，與含有l(wèi)acF基因的乳酸乳球菌表達(dá)載體pN28149聯(lián)合使用，以乳糖為選擇標(biāo)記，是一個(gè)食品級的外源基因表達(dá)系統(tǒng)。 本研究用疑似患PED的病豬腸病料，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得531bp的PEDV部分保護(hù)性抗原基因，將其克

4、隆入pMD18-T載體后測序，核苷酸序列同PEDV CV777株相應(yīng)序列的同源性為99.4％。根據(jù)測序結(jié)果和表達(dá)載體特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對引物，擴(kuò)增PEDV部分保護(hù)性抗原基因(COE基因)501bp。將COE基因與乳酸乳球菌表面表達(dá)載體pN28149進(jìn)行連接，電擊轉(zhuǎn)化入食品級乳酸乳球菌N23900細(xì)胞。重組菌以Ing/mL乳鏈菌肽(Nisin)誘導(dǎo)，通過SDS-PAGE和Western blot分析，PEDV部分S蛋白獲得了表達(dá)，并具有反應(yīng)原性