IHHNV病毒蛋白與凡納濱對蝦圍食膜蛋白的互作研究.pdf

1、本研究采用SMART技術(shù)成功構(gòu)建了凡納濱對蝦腸道組織的全長cDNA文庫，經(jīng)電子拼接和序列比對分析獲得了凡納濱對蝦圍食膜蛋白基因(Peritrophin)全長序列，該基因包含一個(gè)長度為828bp的開放閱讀框(openreading frame，ORF)，編碼275個(gè)氨基酸，理論分子質(zhì)量約30.782 kDa。進(jìn)一步對所獲得的序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示該序列與斑節(jié)對蝦的相似性77.3％，與短溝對蝦的相似性為76.1％，與中國對蝦的相似性為7

2、2.2％，與墨吉對蝦的相似性為62.3％。根據(jù)比對結(jié)果選取一段保守的凡納濱對蝦圍食膜蛋白基因（L.vannamei Peritrophin，LvPT）序列進(jìn)行后續(xù)蛋白功能研究，LvPT序列長為687bp，編碼228個(gè)氨基酸，理論分子質(zhì)量約25.829kDa。
　　根據(jù)IHHNV福建株（GenBank NC_002190.2）的序列，設(shè)計(jì)開放閱讀框CP、NS1和NS2的融合表達(dá)載體引物，并構(gòu)建酵母穿梭表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7-CP、pG

3、BKT7-NS1、pGBKT7-NS2和pGADT7-LvPT;酵母穿梭質(zhì)粒經(jīng)DDO/X/A檢測無自激活現(xiàn)象后用于蛋白互作研究。將重組菌株Y2HGold(pGBKT7-CP，pGBKT7-NS1，pGBKT7-NS2)分別和重組菌株Y187(pGADT7-LvPT)融合mating，經(jīng)DDO/X/A初步篩選發(fā)現(xiàn)均有相互作用，經(jīng)QDO/X/A篩選發(fā)現(xiàn)pGBKT7-CP和pGADT7-LvPT，pGBKT7-NS1和pGADT7-LvPT存

4、在較強(qiáng)的相互作用，而pGBKT7-NS2和pGADT7-LvPT之間的作用較弱，懷疑其為假陽性。由此可見，LvPT蛋白與IHHNV病毒間產(chǎn)生相互作用，而且有可能直接影響病毒侵襲機(jī)體的過程。
　　此外，我們采用RNAi的方法，體外合成dsLvPT后，進(jìn)行體內(nèi)注射干擾LvPT基因的表達(dá)，研究IHHNV病毒在凡納濱對蝦體內(nèi)復(fù)制是否受到抑制。結(jié)果表明，注射dsLvPT后，LvPT表達(dá)下調(diào)，IHHNV病毒的相對拷貝數(shù)與對照組相比顯著降低。進(jìn)