雙孢蘑菇熱脅迫蛋白質(zhì)表達(dá)差異分析.pdf

1、雙孢蘑菇[Agaricus bisporus Lange(Imbach)]是目前世界上人工栽培最廣泛、產(chǎn)量最高、消費量最大的食用菌。它屬于穩(wěn)溫結(jié)實性的菌類，溫度是影響其生長的主要因素。加強(qiáng)和深化雙孢蘑菇的分子生物學(xué)研究，特別是充分運用現(xiàn)代生物技術(shù)研究雙孢蘑菇的熱脅迫蛋白質(zhì)表達(dá)差異以及耐熱分子機(jī)理，對培育耐溫、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的菌株具有十分重要的理論和實踐意義。 首先，本研究對雙孢蘑菇耐溫型02菌株和溫度敏感型8213菌株進(jìn)行ITS鑒定

2、。經(jīng)過ITS鑒定分析，02和8213菌株是雙孢蘑菇種內(nèi)的不同菌株。將02和8213菌株各分為4組：24℃常溫培養(yǎng)、先32℃熱誘導(dǎo)6h，再37℃熱處理6h、37℃熱處理12h和42℃熱處理12h。觀察不同溫度處理條件下菌絲體的形態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：02菌株比8213菌株耐高溫；較低的亞致死誘導(dǎo)溫度對于提高熱耐受能力是有幫助的。 其次，通過雙向電泳聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)研究02菌株熱處理前后總蛋白2—DE圖譜的變化以及同時熱處理的02和8213

3、菌株的總蛋白2—DE圖譜差異，并對差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點進(jìn)行MALDI—TOF—MS分析。2—DE圖譜分析結(jié)果表明：熱處理后的02菌株，有32個蛋白質(zhì)斑點出現(xiàn)明顯的差異，其中熱誘導(dǎo)出現(xiàn)蛋白質(zhì)5個，表達(dá)量上調(diào)蛋白質(zhì)14個，抑制表達(dá)蛋白質(zhì)4個，表達(dá)量下調(diào)蛋白質(zhì)9個；02和8213菌株同時熱處理后，有41個蛋白質(zhì)斑點有較為明顯的差異，其中18個蛋白質(zhì)為02菌株獨有，17個蛋白質(zhì)在02菌株中表達(dá)上調(diào)；3個蛋白質(zhì)為8213菌株獨有，3個蛋白質(zhì)在821

4、3菌株中表達(dá)上調(diào)。應(yīng)用MALDI—TOF—MS分析73個差異蛋白質(zhì)點，在MASCOT數(shù)據(jù)庫中檢索比對，共鑒定出58個差異表達(dá)蛋白質(zhì)。將這58個已鑒定差異蛋白質(zhì)序列在COGs數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對功能分類，可分為以下幾類：分子伴侶類、能量代謝類、物質(zhì)代謝類、細(xì)胞過程和信號傳導(dǎo)類、遺傳信息類及功能未知蛋白質(zhì)。功能簇中分子伴侶蛋白質(zhì)共有6個，占全部已鑒定差異蛋白質(zhì)的10.3％，這表明包括熱激蛋白在內(nèi)的分子伴侶蛋白質(zhì)對于耐高溫可能起重要的作用。與能量

5、代謝和物質(zhì)代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)有14個，占全部已鑒定差異蛋白質(zhì)的24.1％，說明在熱處理中雙孢蘑菇的正常的能量和物質(zhì)代謝受到了干擾。細(xì)胞信號、遺傳信息傳遞相關(guān)蛋白質(zhì)共有11個，占已鑒定差異蛋白質(zhì)的19％，說明雙孢蘑菇在基因轉(zhuǎn)錄水平上對熱激反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控。在差異蛋白質(zhì)中，有兩個被鑒定為Heat shock protein HSS1和HSP70。HSS1在02菌株熱處理后表達(dá)上調(diào)；在02與8213菌株同時熱處理的蛋白質(zhì)組比較中，HSP70在02菌

6、株蛋白質(zhì)組中表達(dá)量較大。我們通過real—time PCR檢測，發(fā)現(xiàn)02菌株熱處理后HSS1和HSP70基因的表達(dá)量都上升5倍以上；同樣進(jìn)行熱處理的02和8213菌株中，HSS1和HSP70基因在02菌株中的表達(dá)量分別為8213菌株的1.6倍和2.8倍，說明基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)引起了HSS1和HSP70表達(dá)量的提高。本研究通過雙向電泳技術(shù)手段找到一些耐溫02菌株熱處理前后的差異表達(dá)蛋白質(zhì)以及耐溫02菌株和溫度敏感型8213菌株同時熱處理的差