卵巢癌多藥耐藥基因的表達(dá)及其逆轉(zhuǎn).pdf

1、目的: 本實(shí)驗(yàn)使用特異的靶向于MDR1基因的siRNA作用于p-gp陽性表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞株SKOV3/AR，以了解其對MDR1基因的特異性抑制作用，為探討使用siRNA逆轉(zhuǎn)耐藥型卵巢癌多藥耐藥的可行性提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法: 1.使用帶FAM熒光標(biāo)記的siRNA，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，測得轉(zhuǎn)染效率。 2.用靶向于GAPDH的siRNA作為陽性對照，轉(zhuǎn)染SKOV3/AR細(xì)胞，觀察GAPDHmRNA的變化情況，以驗(yàn)證整

2、個實(shí)驗(yàn)流程的正確性。 3.設(shè)計靶向于MDR1基因的三條siRNA，并用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染SKOV3/AR細(xì)胞，使用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后48小時MDR1mRNA的變化，并篩選出干擾效率較高的一條siRNA。 4.將篩選出的siRNA轉(zhuǎn)染SKOV3/AR細(xì)胞，流式細(xì)胞技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后72小時p-gp的變化情況。 5.MTT法檢測轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染后48小時SKOV3/AR細(xì)胞對阿霉素、泰素的敏感性。 結(jié)果:

3、 1.熒光顯微鏡照片fluorescence顯示當(dāng)干擾片段濃度為30nM時候siRNA的轉(zhuǎn)染效率最高。 2.siRNA轉(zhuǎn)染后48小時RT-PCR測得空白組、脂質(zhì)體組及陽性對照組的GAPDHmRNA的相對表達(dá)水平分別是2.46±0.08，2.34±0.04，1.41±0.05，與空白組相比，陽性對照組GAPDHmRNA顯著降低（P<0.05）。 3.轉(zhuǎn)染后48小時RT-PCR結(jié)果提示：siRNA-1組、siRNA-2組

4、、siRNA-3組、空白組、脂質(zhì)體組及陰性對照組MDR1mRNA的表達(dá)水平分別是1.98±0.03，2.05±0.09，1.45±0.08，3.49±0.28，3.46±0.17和3.48±0.26，同空白組相比，前三組MDR1mRNA的表達(dá)水平均有顯著下降（均有P<0.05），它們對MDR1mRNA的抑制率分別是43.3％、41.3％和58.5％。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇對基因抑制率較高的siRNA-3進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。 4.將siR

5、NA-3轉(zhuǎn)染細(xì)胞后72小時流式細(xì)胞儀檢測空白組，脂質(zhì)體組，陰性對照組，干擾組的的p-gp陽性表達(dá)率分別是（84.5±0.07）％、（85.35±0.06）％、（84.87±0.01）％、（52.43±0.07）％，與空白組相比，干擾組p-gp顯著降低（p<0.05），其抑制率為37.95％，而脂質(zhì)體組及陰性對照組無明顯抑制作用（p>0.05）。用siRNA-3干擾SKOV3/AR細(xì)胞后，阿霉素和紫杉醇的IC50分別下降為干擾前的1/3.