葉酸修飾殼聚糖小干擾RNA納米粒靶向逆轉(zhuǎn)卵巢癌多藥耐藥的研究.pdf

1、本研究分為四部分：
　　 第一部分：葉酸-殼聚糖復(fù)合載體的制備及性質(zhì)鑒定
　　 目的：合成葉酸修飾殼聚糖復(fù)合載體，并鑒定葉酸-殼聚糖復(fù)合載體的成功合成，測定葉酸偶聯(lián)率。
　　 方法：1. 用還原酰胺化法合成葉酸修飾殼聚糖復(fù)合載體；2. 通過對合成樣本的紅外光譜測定，確認葉酸修飾殼聚糖復(fù)合載體；3. 紫外掃描確定葉酸成功偶聯(lián)于殼聚糖；4. 通過對比FA 濃度-吸光度標準曲線，測定葉酸偶聯(lián)率。
　　 結(jié)果：1

2、. 獲得了純化的葉酸修飾殼聚糖復(fù)合載體，為淡黃色細致均勻的粉末，溶液為無味，淡黃色透明液體；2. 紅外吸收光譜顯示葉酸修飾殼聚糖復(fù)合載體在1563cm-1處出現(xiàn)新的特征性-CO-NH-振動波，說明-CO-NH-鍵成功在葉酸和殼聚糖間形成；3.紫外吸收光譜顯示葉酸修飾殼聚糖復(fù)合載體在280nm 處出現(xiàn)寬大吸收波，此為葉酸的特征性紫外吸收波長，證實葉酸成功與殼聚糖偶聯(lián)；4. 葉酸濃度在5.2-30.9μg/mL范圍內(nèi)與葉酸吸光度（A）呈良好

3、的線性關(guān)系?；貧w方程為A=0.0127C+0.0016，R2=0.9983。通過改變?nèi)~酸及殼聚糖不同的反應(yīng)比，得到不同的葉酸偶聯(lián)率，共合成四種不同偶聯(lián)率的葉酸修飾殼聚糖復(fù)合載體，分別是3%、7%、11.2%和17%。
　　 結(jié)論：通過還原胺法成功合成葉酸修飾殼聚糖復(fù)合載體，在加入不同比例反應(yīng)物后，共合成4種不同葉酸偶聯(lián)率的葉酸修飾殼聚糖復(fù)合載體。提示可以利用與殼聚糖分子上的活性氨基的化合反應(yīng)，成功修飾殼聚糖，改變其物理化學性能。

4、
　　 第二部分：葉酸修飾殼聚糖siRNA納米粒的制備及性質(zhì)檢測
　　 目的：合成葉酸修飾殼聚糖siRNA 納米粒，并測定其形態(tài)及直徑大小。研究納米粒對不同細胞的毒性及保護DNA免受降解的功能。
　　 方法：1. 采用復(fù)凝聚法合成葉酸修飾殼聚糖PshRNA 納米粒 (FA-CS-PshRNA)和殼聚糖pshRNA 納米粒 (CS-PshRNA)；2. 透射電鏡觀察納米粒形態(tài)、大小，并測定不同葉酸偶聯(lián)率下，納米粒的

5、平均直徑；3.酶保護實驗檢測不同納米粒對質(zhì)粒DNA的成功包裹及保護功能；4. MTT法檢測納米粒對于不同婦科腫瘤細胞系(SKOV3、A2780、CAOV3、HeLa和MCF-7)產(chǎn)生的毒性；5. 選擇葉酸高表達的卵巢癌細胞系SKOV3，乳腺癌細胞系MCF-7和宮頸癌細胞系HeLa作為實驗細胞，在體外培養(yǎng)過程中導(dǎo)入葉酸修飾殼聚糖siRNA 納米粒，熒光倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及綠色熒光蛋白表達量，流式細胞儀檢測不同細胞的轉(zhuǎn)染效率。

6、　　 結(jié)果：1. 本研究通過復(fù)凝聚法，成功合成了葉酸修飾殼聚糖PshRNA 納米粒和殼聚糖PshRNA 納米粒，納米粒溶液為透明、無色、無味溶液；2. 透射電鏡顯示納米粒為近似球型，表面光滑、均質(zhì)的納米粒顆粒。殼聚糖PshRNA 納米粒粒徑為138.4±0.7nm，葉酸修飾殼聚糖PshRNA 納米粒（葉酸偶聯(lián)率：3%、7.5%、11.2%和17%）直徑依次為289.6±0.7nm、78.1±0.3nm、186.6±0.6nm和212.

7、2±0.5±nm；3.酶保護實驗結(jié)果表明殼聚糖及葉酸修飾殼聚糖皆能有效結(jié)合和濃縮DNA形成相應(yīng)納米粒，殼聚糖及葉酸修飾殼聚糖皆能保護DNA不受DNAaseI的降解；4.細胞毒性實驗顯示葉酸修飾殼聚糖PshRNA納米粒和殼聚糖PshRNA納米粒對于不同細胞系亦有不同毒性。經(jīng)殼聚糖PshRNA 納米粒處理后，MCF-7、A2780、CAOV3、SKOV3和HeLa的細胞活力分別是處理前的87.9±2.4%、91.4±1.0%、42.9±2.

8、1%、102.0±4.0%和97.4±1.1%，而經(jīng)葉酸修飾殼聚糖PshRNA 納米粒處理后，上述細胞的細胞活力分別為處理前的63.0±2.5%、90.6±1.3%、50.5±0.7%、106.5±1.8%和99.3±1.6%；5.對于MCF-7，SKOV3細胞系，葉酸修飾殼聚糖PshRNA 納米粒轉(zhuǎn)染效率（16.8±1.2%和24.3±0.7%）明顯高于殼聚糖PshRNA 納米粒（0.3±0.1%和0.7±0.1%）（P＜0.05），

9、殼聚糖PshRNA 納米粒和葉酸修飾殼聚糖PshRNA 納米粒對于HeLa細胞的轉(zhuǎn)染效率分別為4.2±0.4%和4.8±0.9%，二者無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　 結(jié)論：通過復(fù)凝聚法成功合成葉酸修飾殼聚糖PshRNA納米粒和殼聚糖PshRNA納米粒。不同葉酸偶聯(lián)率影響納米粒直徑大小，在7.5%的葉酸偶聯(lián)率下，納米粒直徑最?。?8.1±0.3nm）。葉酸修飾殼聚糖PshRNA 納米粒和殼聚糖PshRNA 納米粒皆能穩(wěn)定包裹

10、質(zhì)粒DNA，并能保護其免受DNAase I的酶解。在葉酸介導(dǎo)下，葉酸修飾殼聚糖PshRNA 納米粒的轉(zhuǎn)染效率明顯高于殼聚糖PshRNA 納米粒。提示通過葉酸修飾，明顯提高了殼聚糖PshRNA 納米粒的轉(zhuǎn)染效率。
　　 第三部分：卵巢癌SKOV3 耐藥細胞株建立及耐藥性的研究
　　 目的：培養(yǎng)經(jīng)泰素誘導(dǎo)SKOV3 多藥耐藥細胞株，檢測MDR1 編碼蛋白P-gp 在SKOV3親本株和耐藥株中的表達差異，探討MDR1基因表達與

11、多藥耐藥的相關(guān)性。為研究靶向MDR1的葉酸修飾殼聚糖siRNA 納米粒逆轉(zhuǎn)卵巢癌多藥耐藥提供細胞學基礎(chǔ)。
　　 方法：1. 以泰素為誘導(dǎo)劑，采用體外濃度梯度遞增法建立卵巢癌SKOV3-ts 多藥耐藥細胞株；2. MTT法檢測SKOV3 親本株和耐藥株中對紫杉醇和阿霉素的IC50的改變；3. Western-blot和激光共聚焦法檢測SKOV3 親本株和耐藥株中P-gp 蛋白的表達差異。
　　 結(jié)果：1. 本章通過濃度梯度

12、遞增法成功建立了卵巢癌SKOV3 多藥耐藥細胞株SKOV3-ts。該細胞株由體積相對較小的梭型變?yōu)轶w積膨脹的不規(guī)則形狀，有些細胞呈星狀和分支狀結(jié)構(gòu)，較SKOV3細胞大；2. 應(yīng)用半定量Western-blot檢測出在SKOV3-ts 及SKOV3細胞系中P-gp的表達量分別是1.15±0.02、0.08±0.01，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。激光共聚焦法顯示SKOV3細胞中只有微量P-gp表達，而SKOV3-ts細胞的細胞膜上顯示

13、較強P-gp的表達；3. SKOV3和SKOV3-ts對紫杉醇的IC50 分別是0.0048±0.0002和0.3957±0.0075，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），對阿霉素的IC50 分別是0.0066±0.0006和0.2210±0.0046，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　 結(jié)論：通過濃度梯度遞增法成功建立了卵巢癌SKOV3 多藥耐藥細胞株SKOV3-ts，耐藥細胞SKOV3-ts的P-gp表達量明顯高于親本細

14、胞系SKOV3，對紫杉醇和阿霉素的IC50 較親本細胞有明顯升高。提示MDR1的過度表達與SKOV3細胞的多藥耐藥的產(chǎn)生有明顯相關(guān)性，SKOV3-ts細胞耐藥可對阿霉素產(chǎn)生交叉耐藥，同時獲得細胞膜P-gp高表達。故SKOV3-ts細胞可以作為卵巢癌耐藥細胞模型，用作葉酸受體介導(dǎo)的納米靶向修飾逆轉(zhuǎn)卵巢癌多藥耐藥的研究。
　　 第四部分：葉酸修飾殼聚糖siRNA 納米粒靶向逆轉(zhuǎn)SKOV3-ts細胞耐藥的研究
　　 目的：檢測

15、葉酸修飾殼聚糖siRNA 納米粒與殼聚糖siRNA 納米粒對SKOV3-ts細胞系MDR1表達的影響，探討經(jīng)葉酸修飾后，納米粒逆轉(zhuǎn)SKOV3-ts細胞系耐藥性的改變。
　　 方法：1. 在SKOV3-ts細胞體外培養(yǎng)過程中導(dǎo)入葉酸修飾殼聚糖PshRNA納米粒和殼聚糖PshRNA 納米粒，其中PshRNA 為可表達靶向MDR1基因的siRNA的真核表達質(zhì)粒，故而稱為葉酸修飾殼聚糖siRNA 納米粒和殼聚糖siRNA 納米粒；2.

16、RT-PCR法檢測納米粒轉(zhuǎn)染SKOV3-ts細胞前后，MDR1mRNA表達改變；3. 用Western-blot法檢測納米粒轉(zhuǎn)染SKOV3-ts細胞前后，MDR1 編碼蛋白P-gp的表達改變；4. MTT法檢測納米粒轉(zhuǎn)染SKOV3-ts細胞前后，對紫杉醇耐藥IC50的改變。
　　 結(jié)果：1.半定量RT-PCR檢測出殼聚糖siRNA納米粒與葉酸修飾殼聚糖siRNA納米粒轉(zhuǎn)染SKOV3-ts細胞后，MDR1mRNA表達量分別是0.7

17、5±0.01、0.27±0.01，差異有顯著意義（P<0.05）；2. 半定量Western-blot法檢測出殼聚糖siRNA 納米粒與葉酸修飾殼聚糖siRNA 納米粒轉(zhuǎn)染SKOV3-ts細胞后，P-gp表達量分別是0.62±0.01、0.12±0.01，差異有顯著意義（P<0.05）；3. MTT法檢測殼聚糖siRNA 納米粒與葉酸修飾殼聚糖siRNA 納米粒轉(zhuǎn)染SKOV3-ts細胞后，針對PTX的IC50 分別為0.3830±0.0