雙配體修飾的殼聚糖納米粒肝癌細胞主動靶向給藥系統(tǒng)的研究.pdf

1、肝癌是我國第二位惡性腫瘤，每年死亡人數約11萬人，占世界肝癌死亡人數的40％。因此，在我國對肝癌藥物治療方法進行深入的研究顯得更為必要。目前研究較熱的肝靶向給藥系統(tǒng)雖然提高了抗癌藥物在肝臟的濃度，降低了藥物對正常組織器官的毒副作用，卻多數無分辨正常肝細胞與癌變的肝細胞的能力，在殺死癌細胞的同時，也殺死了正常的肝細胞，給肝臟功能造成損傷，如能制備一可靶向至肝癌細胞的給藥系統(tǒng)，則可提高抗癌藥物在肝臟癌變部位的濃度，降低藥物對正常肝組織的毒副

2、作用，使藥效和治療指數進一步提高。 本課題選擇中藥抗癌有效成分自藜蘆醇為模型藥物，以殼聚糖(CS)為載體材料，制備殼聚糖納米粒(CS-NP)，并在納米粒上連接配體生物素Biotin與抗生物素蛋白Avidin，得到雙配體修飾的納米粒A-B-CS-NP。Avidin的N末端含乙酰半乳糖氨和甘露糖殘基，通過與肝臟表面半乳糖和甘露糖受體的相互作用，Avidin可介導納米粒靶向至肝臟；Avidin與Biotin對癌細胞有特殊的親和力，兩個

3、配體可進一步介導納米粒到達癌細胞，有望實現(xiàn)對肝癌細胞的主動靶向。 為使配體Biotin順利連接到CS上，采用沉淀法制備CS-NP。用單因素法優(yōu)化制備工藝，制得的白藜蘆醇殼聚糖納米粒(Rcs-CS-NP)包封率為65％，載藥量為13％，平均粒徑為300 nm，多分散系數為0.254，體外釋放行為可用雙指數雙向動力學描述。沉淀法制備一般常用硫酸鈉溶液作為沉淀劑，制得的微粒粒徑多在u m級；而本研究以氯化鈉溶液作為沉淀劑，使CS的氨基

4、保持游離，微粒的粒徑達到nm級，在制備工藝上具創(chuàng)新性。 使用試劑Sulfo-NHS-Biotin與CS的氨基反應生成生物素化的殼聚糖Bio-CS，采用CS-NP的制備工藝制得Biotin修飾的殼聚糖納米粒B-CS-NP；在B-CS-NP溶液中，利用Avidin與Biotin之間有很強的親和力，分別按Biotin：Avidin(2：1)及Biotin：Avidin(1：1)的比例加入Avidin溶液，得到Avidin與Biotin

5、雙配體修飾的納米粒A-B-CS-NP及Avidin修飾的納米粒A-CS-NP。 選用試劑盒，以HABA染料法成功地測定了包封白藜蘆醇的B-CS-NP及A-B-CS-NP表面Biotin的連接密度，以mmols Biotin／mmols CS為單位，分別為2及1；含藥B-CS-NP平均粒徑為263 nm，多分散系數為0.170；含藥A-B-CS-NP平均粒徑為319nm，多分散系數為0.155；兩種納米粒的包封率在65％左右，載藥

6、量在11％左右；體外釋放過程均符合雙指數雙向動力學方程。本部分研究選擇簡單的合成反應與結合途徑，在國際上率先將分別具有肝靶向及癌細胞靶向功能的配體Avidin與Biotin連接至CS-NP上，以彌補單一配體修飾載體對特定組織的特定細胞靶向能力的不足，增強給藥系統(tǒng)對肝臟癌細胞的特異性，并建立了相應的質量評價方法，構思新穎、巧妙、嚴謹，具較強的創(chuàng)造性。 在動物體內分布研究中，以白藜蘆醇溶液為對照，采用HPLC法測定了各納

7、米制劑經小鼠尾靜脈注射后，不同時間點藥物的體內分布情況。含藥CS-NP、B-CS-NP及A-B-CS-NP對肝臟的相對靶向效率分別為白藜蘆醇對照溶液的2.29，1.66及2.54倍，表明Avidin配體的引入提高了納米粒對肝臟的靶向性，雙配體修飾的A-B-CS-NP具有明顯的肝靶向作用。利用已證實的Avidin對肝臟的主動靶向性，以Biotin作中介，將Avidin連接至納米粒上，以增強納米粒對肝臟的靶向能力，此部分研究國內外未見報道。

8、 用FITC標記納米粒，使用酶標儀定量考察了人肝癌HepG2細胞對納米粒的攝取情況。結果顯示，細胞對單配體及雙配體修飾的納米粒的攝取量明顯高于無配體修飾的納米粒CS-NP(P<0.05)：配體修飾的納米粒存在劑量飽和現(xiàn)象；在高劑量時，A-B-CS-NP有最大的細胞攝入量。Avidin或Biotin配體對細胞攝取的抑制實驗結果顯示，配體修飾的納米粒主要通過受體介導的主動轉運機制為肝癌細胞所攝取，雙配體修飾的A-B-CS-NP顯

9、著提高了肝癌細胞的攝入量，達到了課題的預期目的。 以白藜蘆醇溶液為對照，用MTT法比較了各含藥納米制劑體外對人肝癌HepG2細胞的活性。結果發(fā)現(xiàn)，單配體與雙配體修飾的納米粒對人肝癌HepG2細胞的抑制作用明顯高于白藜蘆醇對照溶液及無配體修飾的納米粒CS-NP(P<0.05)。在最佳作用濃度點，經統(tǒng)計學分析，雙配體修飾的A-B-CS-NP對細胞抑制作用顯著高于Avidin修飾的A-CS-NP(P<0.05)，與Biotin修飾的B

10、-CS-NP無明顯差異。由此，從體外藥效學角度證實了A-B-CS-NP靶向至肝癌細胞的有效性。 本研究在國際上首次成功制備了配體Avidin與Biotin雙重修飾的白藜蘆醇殼聚糖納米粒A-B-CS-NP，建立了該給藥系統(tǒng)體內外評價方法，通過體內分布，體外細胞攝取與活性研究證實了A-B-CS-NP對肝臟的靶向性，對肝癌細胞的主動靶向作用及顯著的殺傷能力。以上研究內容國內外均未見報道。此新型給藥系統(tǒng)利用配體Avidin與Bioti