大腸癌血清、尿液和組織比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、本研究旨在通過整體系統(tǒng)的研究大腸癌蛋白質(zhì)組，包括血清、手術(shù)標(biāo)本組織、尿液等蛋白質(zhì)表達(dá)變化，并最終建立一個標(biāo)志物組合診斷模型的研究，對于提高標(biāo)志物的敏感度和特異性，深入認(rèn)識大腸癌的發(fā)病和發(fā)展機(jī)制，以及為投入到實(shí)際臨床檢測奠定較好的理論基礎(chǔ)等都有著重要意義。整個實(shí)驗(yàn)為三部分組成，內(nèi)容如下：
　　 第一部分利用磁珠結(jié)合AU及NP20兩種蛋白質(zhì)芯片對大腸癌患者血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 目的：利用磁珠結(jié)合表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時

2、間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)篩選大腸癌特征性血清標(biāo)志蛋白質(zhì)。
　　 方法：
　　 采用磁珠結(jié)合美國Ciphergen公司的AU和NP20兩種芯片和表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時間質(zhì)譜儀，檢測110份血清標(biāo)本中的蛋白質(zhì)相對含量，其中包括49例大腸癌患者，和61例正常人的血清，得到各組蛋白質(zhì)的質(zhì)譜圖。進(jìn)一步采用CiphergenBiosystems軟件進(jìn)行波譜分析，從而得到能夠正確分組的特異性蛋白標(biāo)志物并構(gòu)建大腸癌診斷

3、模型。
　　 結(jié)果：
　　 獲得的質(zhì)譜圖用Ciphergen公司的Biomarker Wizard和Biomarker Pattern軟件分析，AU芯片篩選出大腸癌與正常人組差異蛋白峰有154個，其中M/Z值為13912.3Da的蛋白質(zhì)作為血清標(biāo)志物建立診斷模型可將正常人與大腸癌患者準(zhǔn)確的分組，敏感性97.96％，特異性為100％。其M/Z值分別為5021.03Da和13991.6Da兩個蛋白質(zhì)組成的血清標(biāo)志物診斷模型可

4、以將大腸癌早期與大腸癌晚期較好的分組，其正確率為85.71％，靈敏度為88.24％，特異性為80.0％。NP20芯片篩選出大腸癌與正常人組差異蛋白峰有150個，其中M/Z值為13732.4Da的蛋白質(zhì)作為血清標(biāo)志物建立診斷模型可將正常人與大腸癌患者準(zhǔn)確的分組，靈敏度為97.96％，特異性為98.36％。其M/Z值分別為2041.02Da、7525.45 Da和2356.20 Da三個蛋白質(zhì)組成的血清標(biāo)志物診斷模型可以將大腸癌早期與大腸癌

5、晚期較好的分組，其正確率為85.71％，靈敏度為97.06％，特異性為60.0％。
　　 結(jié)論：利用磁珠結(jié)合表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)對大腸癌患者及正常人血清的血清蛋白質(zhì)譜進(jìn)行分析，得到的高敏感性和特異性血清蛋白質(zhì)模板，可對大腸癌做出快速和準(zhǔn)確的判斷，為大腸癌的早期診斷和治療提供了可能，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。
　　 第二部分利用磁珠結(jié)合H4蛋白質(zhì)芯片對大腸癌患者尿液蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 目的：利用磁珠

6、結(jié)合表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)篩選大腸癌特征性尿液標(biāo)志蛋白質(zhì)。
　　 方法：采用磁珠結(jié)合美國Ciphergen公司的H4芯片和表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時間質(zhì)譜儀，檢測90份尿液標(biāo)本中的蛋白質(zhì)相對含量，其中包括43例大腸癌患者，和47例正常人的尿液，得到各組蛋白質(zhì)的質(zhì)譜圖。進(jìn)一步采用Ciphergen Biosystems軟件進(jìn)行波譜分析，從而得到能夠正確分組的特異性蛋白標(biāo)志物并構(gòu)建大腸癌診斷

7、模型。
　　 結(jié)果：獲得的質(zhì)譜圖用Ciphergen公司的Biomarker Wizard和Biomarker Pattern軟件分析，H4芯片篩選出大腸癌與正常人組差異蛋白峰有106個，其中M/Z值為2458.07Da、3743.32Da和1690.40Da的蛋白質(zhì)作為尿液標(biāo)志物建立診斷模型可將正常人與大腸癌患者準(zhǔn)確的分組，敏感性86.05％，特異性為89.36％。
　　 結(jié)論：SELDI-TOF-MS蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是

8、一種快速、簡便易行、用量少和高通量分析方法，能直接篩選出大腸癌患者尿液中相對特異的潛在標(biāo)記物，具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　 第三部分利用雙向凝膠電泳技術(shù)對大腸癌組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 目的：利用雙向凝膠電泳技術(shù)研究大腸癌組及癌旁正常粘膜組蛋白質(zhì)組表達(dá)的差異，分析和鑒定兩組間特異表達(dá)的蛋白質(zhì)，探索大腸癌的發(fā)生機(jī)制。
　　 方法：切取新鮮大腸癌標(biāo)本和癌旁正常腸粘膜，置于-80℃保存。分兩組：大腸癌組及正常粘膜組，

9、將兩組標(biāo)本進(jìn)行捻磨、裂解，制備蛋白樣品溶液。先采用雙向凝膠電泳分離蛋白，凝膠以考馬斯亮藍(lán)染色，圖片采用PD-quest軟件分析并確定組間差異點(diǎn)。然后將兩組間差異蛋白點(diǎn)切割，酶解后行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫鑒定。然后采用免疫印跡(Western Blot)和免疫組織化學(xué)方法驗(yàn)證部分差異表達(dá)蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：各組凝膠圖像清晰，平均檢測蛋白斑點(diǎn)數(shù)癌旁正常粘膜組537±28個，大腸癌組526±34個。經(jīng)過軟件

10、匹配分析，在2組標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)存在有特異表達(dá)的蛋白質(zhì)18個，其中5個經(jīng)過鑒定為3-磷酸甘油醛脫氫酶、熱休克蛋白27、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、果糖-二磷酸醛縮酶、β-酮酯酰載體蛋白合酶。Western Blot和免疫組化結(jié)果顯示GST、HSP27的表達(dá)在大腸癌組織中均高于癌旁正常粘膜，與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究大腸癌與正常粘膜組的蛋白質(zhì)組表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)大腸癌組與正常粘膜組在蛋白質(zhì)表達(dá)上存在一定的差異