應(yīng)用蛋白指紋圖譜技術(shù)對(duì)大腸癌及其肝轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)組的研究.pdf

1、目的：應(yīng)用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)對(duì)比分析大腸癌肝轉(zhuǎn)移患者、大腸癌患者與健康對(duì)照者的血清蛋白質(zhì)分子含量，從中篩選出大腸癌肝轉(zhuǎn)移患者血清特異性相關(guān)蛋白，從而尋找大腸癌肝轉(zhuǎn)移的特異性生物標(biāo)志，并利用計(jì)算機(jī)軟件構(gòu)建大腸癌肝轉(zhuǎn)移的診斷模型，對(duì)于大腸癌肝轉(zhuǎn)移的診斷及預(yù)后的

2、評(píng)估有重要臨床意義。 方法：128例血清標(biāo)本，其中健康對(duì)照者48例，大腸癌患者44例，大腸癌肝轉(zhuǎn)移患者36例。大腸癌患者中包括直腸癌患者有28例，結(jié)腸癌患者16例。均經(jīng)過(guò)術(shù)后組織病理診斷。大腸癌肝轉(zhuǎn)移組有36例，均經(jīng)過(guò)影像學(xué)檢查或病理確診。各組病例中均無(wú)影響血清中蛋白質(zhì)含量的其它相關(guān)性疾病。采用美國(guó)Ciphergen公司的IMAC3(Immobilized Metal Affinity Capture，金屬親和表面)芯片和表面增

3、強(qiáng)激光電離及解析飛行時(shí)間質(zhì)譜儀檢測(cè)48例健康對(duì)照者，44例大腸癌患者及36例大腸癌肝轉(zhuǎn)移患者血清中的蛋白質(zhì)相對(duì)含量。設(shè)定所有血清樣本檢測(cè)的蛋白質(zhì)分子量區(qū)間在1，500～20，000 Da。利用PBSⅡ型蛋白質(zhì)芯片閱讀儀對(duì)IMAC 3芯片進(jìn)行檢測(cè)，所得到的蛋白質(zhì)以波譜的形式表示。用飛行質(zhì)譜儀對(duì)大腸癌患者、大腸癌肝轉(zhuǎn)移患者、健康對(duì)照者等三組血清進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，再分5組進(jìn)行差異性蛋白分析比較：①大腸癌組、大腸癌肝轉(zhuǎn)移組。②健康對(duì)照組、大腸癌組。

4、④健康對(duì)照組、大腸癌組、大腸癌肝轉(zhuǎn)移組。④大腸癌Dukes B期組、大腸癌肝轉(zhuǎn)移組。⑤大腸癌Dukes C期組、大腸癌肝轉(zhuǎn)移組。采用Biomarker wizard軟件對(duì)每個(gè)組合內(nèi)的相同質(zhì)荷比不同蛋白含量進(jìn)行分析比較，找到組合內(nèi)蛋白含量有顯著差異的質(zhì)荷比。將組合內(nèi)含量有顯著差異(P<0.05)的蛋白質(zhì)建立數(shù)據(jù)庫(kù)，并導(dǎo)入Biomarker Pattern統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，選擇相應(yīng)條件，對(duì)其進(jìn)行分組統(tǒng)計(jì)，從而得到能夠正確分組的特異性蛋白

5、標(biāo)志物并利用特異蛋白標(biāo)志物構(gòu)建大腸癌肝轉(zhuǎn)移的診斷模型。另外再收集大腸癌肝轉(zhuǎn)移患者27例，均經(jīng)過(guò)影像學(xué)檢查確診，未經(jīng)放化療及其他治療手段干預(yù)。用Biomarker Pattern軟件對(duì)大腸癌與大腸癌肝轉(zhuǎn)移組已建立的決策樹(shù)狀診斷模型中的驗(yàn)證模式對(duì)這27例大腸癌肝轉(zhuǎn)移患者進(jìn)行驗(yàn)證檢測(cè)。其結(jié)果與血清CEA檢測(cè)結(jié)果比較。CEA檢測(cè)按照癌胚抗原(CEA)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，參考值為5.0ng/ml。檢測(cè)同一批血清標(biāo)本中的CEA水平，與

6、構(gòu)建的診斷模型在大腸癌肝轉(zhuǎn)移診斷中作比較。 結(jié)果：①大腸癌組、大腸癌肝轉(zhuǎn)移組：血清蛋白質(zhì)在質(zhì)荷比為M2685至M11813間有差異的蛋白質(zhì)峰為25個(gè)，有9種蛋白含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，有5種蛋白在大腸癌肝轉(zhuǎn)移組明顯高表達(dá)，其余4種蛋白低表達(dá)。對(duì)此構(gòu)建了以相對(duì)分子量為M5909、M5341、M2685、M2871、M3928、M6635、M8933蛋白質(zhì)組成的診斷模型。其中44例大腸癌患者中有38例患者被正確分組，

7、36例大腸癌肝轉(zhuǎn)移患者被正確識(shí)別，準(zhǔn)確率為92.5％(74/80)，用本診斷模型診斷得出靈敏度和特異度分別為100％(36/36)，86.36％(38/44)。②健康對(duì)照組、大腸癌組：檢測(cè)到18種蛋白含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。選擇其中3個(gè)質(zhì)荷比作為生物標(biāo)志物構(gòu)建出最佳的大腸癌肝臟轉(zhuǎn)移診斷模型。其準(zhǔn)確率為97.83％(90/92)，靈敏度為95.45％(42/44)，特異度10096(48/48)。④健康對(duì)照組、大腸癌組、大

8、腸癌肝轉(zhuǎn)移組：血清經(jīng)蛋白芯片檢測(cè)分析對(duì)比共檢測(cè)出29個(gè)質(zhì)荷比在三組蛋白含量中有差別，其中22個(gè)質(zhì)荷比的蛋白含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。根據(jù)軟件分析選擇其中12個(gè)質(zhì)荷比作為生物標(biāo)志物構(gòu)建出最佳的大腸癌肝臟轉(zhuǎn)移診斷模型。其準(zhǔn)確率為96.9％(124/128)，靈敏度為91.67％(33/36)，特異度98.91％(91/92)。④大腸癌Dukes B期組、大腸癌肝轉(zhuǎn)移組：檢測(cè)到11個(gè)質(zhì)荷比的蛋白含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.0

9、5)。選擇11個(gè)質(zhì)荷比作為生物標(biāo)志物構(gòu)建出最佳的大腸癌肝臟轉(zhuǎn)移診斷模型。其準(zhǔn)確率為90.32％(56/62)，靈敏度為88.89％(32/36)，特異性92.31％(24/26)。⑤大腸癌Dukes C期組、大腸癌肝轉(zhuǎn)移組：檢測(cè)到11個(gè)質(zhì)荷比的蛋白含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。選擇其中3個(gè)質(zhì)荷比作為生物標(biāo)志物構(gòu)建出最佳的大腸癌肝臟轉(zhuǎn)移診斷模型。其準(zhǔn)確率為100％(48/48)，靈敏度為100％(36/36)，特異度100％(1

10、2/12)。⑥應(yīng)用CEA血清檢測(cè)作為對(duì)照比較，本實(shí)驗(yàn)方法診斷大腸癌肝轉(zhuǎn)移的靈敏度和特異度分別為85.19％(23/27)，70.37％(19/27)。兩種檢測(cè)結(jié)果用四格表X<'2>檢驗(yàn)分析，X<'2>=1.714，v=1，P=0.190(雙側(cè))，差異無(wú)顯著性意義。 結(jié)論：本研究旨在通過(guò)對(duì)血清中蛋白質(zhì)組的質(zhì)譜分析來(lái)發(fā)現(xiàn)可用于大腸癌肝轉(zhuǎn)移診斷的蛋白質(zhì)組構(gòu)型。利用SELDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)健康對(duì)照組，大腸癌組和大腸癌肝轉(zhuǎn)移組患者的