枯草芽孢桿菌配合滅活TGEV口服免疫對(duì)仔豬黏膜免疫力的影響.pdf

1、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV)是一種腸道病原體，能引起兩周齡以下仔豬發(fā)生嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、脫水，具有高致死率。該病主要通過消化道進(jìn)行傳播，口服免疫能直接切斷豬傳染性胃腸炎病毒的傳播途徑，有效控制該病的發(fā)生。然而單獨(dú)口服滅活全病毒并不能有效激發(fā)黏膜處的免疫應(yīng)答，需要選擇合適的黏膜佐劑來增強(qiáng)滅活全病毒的免疫原性，進(jìn)而達(dá)到更好的免疫效果。近年來黏膜增強(qiáng)劑的

2、開發(fā)為黏膜免疫帶來了生機(jī)?？莶菅挎邨U菌（B.subtilis）是一種廣泛存在于土壤和植物中的優(yōu)勢(shì)益生菌種群，具有耐熱、耐干燥、價(jià)格低、便于運(yùn)輸?shù)葍?yōu)勢(shì)。其能拮抗動(dòng)物病原菌，刺激動(dòng)物免疫器官生長和發(fā)育，刺激B、T淋巴細(xì)胞增殖，可以增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫力。已證實(shí)B.subtilis能作為高效的黏膜佐劑，增強(qiáng)口服免疫效果，利用枯草芽孢桿菌作為黏膜免疫增強(qiáng)劑已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。在小鼠上利用枯草芽孢桿菌作為有效的黏膜佐劑已取得較好的結(jié)果，但在豬上的

3、相關(guān)報(bào)道卻很少。因此本研究通過體外和體內(nèi)試驗(yàn)探索枯草芽孢桿菌配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫對(duì)仔豬黏膜免疫力的影響，為更有效、方便地預(yù)防豬傳染性胃腸炎提供理論基礎(chǔ)。首先，將24頭6周齡三元仔豬隨機(jī)分為4組進(jìn)行首次免疫，一周后加強(qiáng)免疫，方法與劑量同首免，試驗(yàn)期內(nèi)均飼喂無抗飼料，自由飲水。首免后42天進(jìn)行剖殺，通過組織切片技術(shù)檢測(cè)小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞（Intraepithelial lymphocyte，IEL）和CD3+T淋巴細(xì)胞數(shù)目的變

4、化，以此探討枯草芽孢桿菌配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫對(duì)消化道局部細(xì)胞免疫水平的影響。此外，通過間接ELISA檢測(cè)糞便和小腸組織中豬傳染性胃腸炎病毒特異性SIgA抗體水平的變化來探討豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫對(duì)消化道局部體液免疫水平的影響;通過間接ELISA檢測(cè)血清中特異性IgG抗體水平的變化以探討豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫對(duì)全身體液免疫水平的影響。其次，利用仔豬腸結(jié)扎試驗(yàn)，通過熒光定量PCR方法檢測(cè)IL-6、IL-12A和

5、IFN-γ mRNA水平的變化以及通過流式檢測(cè)CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)目的變化以探討枯草芽孢桿菌配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫對(duì)腸黏膜中局部細(xì)胞免疫水平的影響。本研究內(nèi)容主要分為以下三個(gè)部分:
　　1枯草芽孢桿菌配合滅活TGEV口服免疫局部細(xì)胞免疫水平的影響
　　將仔豬小腸結(jié)扎后注射枯草芽孢桿菌和豬傳染性胃腸炎滅活病毒，6h后宰殺，收集小腸組織，應(yīng)用熒光定量PCR方法檢測(cè)IL-6、IL-12A和IFN-γ mRN

6、A的表達(dá)情況。結(jié)果表明:應(yīng)用枯草芽孢桿菌配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒，能顯著提高小腸中IL-6、IL-12A和IFN-γ mRNA水平(P＜0.01);單獨(dú)應(yīng)用豬傳染性胃腸炎滅活病毒不能增加IL-6和IFN-γ mRNA水平，但能增加IL-12A的mRNA表達(dá)量（P＜0.01）。
　　回腸末端結(jié)扎后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化。結(jié)果表明:應(yīng)用枯草芽孢桿菌配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒，相比于單獨(dú)應(yīng)用豬傳染

7、性胃腸炎滅活病毒能顯著增加CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量（P＜0.01）。
　　仔豬口服免疫42天后剖殺，采集小腸組織固定后，石蠟包埋并制作組織切片，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法顯示小腸CD3+T淋巴細(xì)胞的分布及數(shù)量變化，結(jié)果表明:應(yīng)用枯草芽孢桿菌配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫能顯著增加小腸絨毛處CD3+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量(P＜0.01)。
　　應(yīng)用HE染色法顯示豬小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的分布及數(shù)量變化。結(jié)果表明:應(yīng)用枯草芽孢桿菌

8、配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫能顯著增加小腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量(P＜0.01）。
　　以上四個(gè)試驗(yàn)結(jié)果提示，應(yīng)用枯草芽孢桿菌配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫可以有效增強(qiáng)仔豬消化道局部細(xì)胞免疫水平。
　　2枯草芽孢桿菌配合滅活TGEV口服免疫對(duì)局部體液免疫水平的影響
　　應(yīng)用間接ELISA分別檢測(cè)每周糞便中豬傳染性胃腸炎病毒特異性SIgA抗體水平，結(jié)果表明:首免后前三周，應(yīng)用枯草芽孢桿菌配合豬傳染性胃腸炎滅活

9、病毒口服免疫后，仔豬糞便中特異性SIgA抗體水平顯著提高(P＜0.01）;至首免第四周，特異性SIgA抗體水平逐漸下降，各組之間無顯著差異。應(yīng)用間接ELISA檢測(cè)小腸組織中特異性SIgA抗體水平，結(jié)果表明:應(yīng)用枯草芽孢桿菌配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫后能顯著增加小腸組織中特異性SIgA抗體水平(P＜0.01）。
　　以上兩個(gè)試驗(yàn)結(jié)果提示，應(yīng)用枯草芽孢桿菌配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫可有效增強(qiáng)仔豬消化道局部體液免疫水平。

10、
　　3枯草芽孢桿菌配合滅活TGEV口服免疫全身免疫水平的影響
　　應(yīng)用間接ELISA分別檢測(cè)每周血清中豬傳染性胃腸炎病毒特異性IgG抗體水平，結(jié)果表明:首免后前四周，枯草芽孢桿菌配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫能顯著提高血清中特異性IgG抗體水平(P＜0.01);至首免第五周，各組血清中特異性IgG抗體水平下降至正常水平，各組之間無顯著差異。
　　結(jié)果提示，應(yīng)用枯草芽孢桿菌配合豬傳染性胃腸炎滅活病毒口服免疫能夠有效