人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向表皮樣細(xì)胞分化的研究.pdf

1、皮膚移植是治療大面積燒傷和糖尿病頑固性皮膚潰瘍等皮膚缺損的主要手段之一。其皮源主要有自體皮、同種異體皮、異種皮及人工皮。自體皮是最理想的皮膚移植物，但對大面積燒傷患者來說，自體皮常常不足，而且自體供皮區(qū)疼痛易感染和瘢痕增生。同種異體皮和異種皮存在免疫原性而發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，僅能在受體成活3周左右，一般用來做大面積燒傷切、削痂后創(chuàng)面的臨時覆蓋物。而且有可能攜帶病毒易傳播疾病。近幾年，隨著組織工程的興起，人們認(rèn)識到組織工程化皮膚具有能修復(fù)受

2、損組織和可能替代部分組織功能的獨特優(yōu)勢，各國都加大了對組織工程化皮膚的研發(fā)力度。在美國，組織工程化皮膚是FDA批準(zhǔn)最早用于臨床組織工程的產(chǎn)品，其代表產(chǎn)品有Dermagraft-TM，Dermagraft-TC和Apligraf(TM)。但上述產(chǎn)品均以異體表皮細(xì)胞或/和異體成纖維細(xì)胞作為種子細(xì)胞，所以仍然是臨時性覆蓋物。真正的永久性存活組織工程化皮膚的開發(fā)不僅需要具有良好生物活性和相容性的支架，還需要具有功能的不被排斥的種子細(xì)胞。目前國內(nèi)

3、外對支架的研究已接近成熟，用PLA、PGA和膠原等材料和成纖維細(xì)胞構(gòu)建的組織工程化真皮具有良好的生物相容性和促進(jìn)傷口愈合的能力，但要成為商品的全層組織工程化皮膚關(guān)鍵還在于表皮成分的種子細(xì)胞。近幾年隨著干細(xì)胞研究是深入和分子生物學(xué)的進(jìn)步，使得皮膚組織工程種子細(xì)胞的問題有了解決希望。 組織工程化皮膚的種子細(xì)胞主要為表皮系細(xì)胞(包括角質(zhì)形成細(xì)胞[KC]/表皮干細(xì)胞[KSC])和其他干細(xì)胞，包括胚胎干細(xì)胞(ES)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MS

4、C)等。自體KC/KSC做種子細(xì)胞則受自體皮不足的困擾，異體KC/KSC存在免疫排斥反應(yīng)，應(yīng)用都受到了限制。ES要從人早期胚胎(妊娠12周內(nèi))組織獲取功能細(xì)胞，但是從胚胎獲取細(xì)胞涉及社會倫理學(xué)問題，不同社會制度、文化背景和對倫理學(xué)的認(rèn)識、理解不同，在不同國家有著各自的相關(guān)政策法規(guī)，影響了胚胎的臨床應(yīng)用。MSC具有取材方便、免疫排斥反應(yīng)小、增殖能力強、具有多向分化潛能和易于外源性基因的導(dǎo)入和表達(dá)等特點，不涉及倫理學(xué)，是理想的種子細(xì)胞。

5、 MSC是一種具有多向分化潛能的細(xì)胞，在特定的條件下可向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、肌腱、脂肪細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞樣細(xì)胞分化。間充質(zhì)干細(xì)胞存在于多種組織中，如骨髓、骨膜、胸腺、皮膚、脂肪和肌肉等。其中，骨髓MSC易于分離純化，在體外具有極強的增殖能力，是目前組織工程和創(chuàng)傷愈合研究中常用的干細(xì)胞來源。目前骨髓MSC分離培養(yǎng)方法普遍采用的是密度梯度分離法。近年來的研究表明成人骨髓細(xì)胞還能在體內(nèi)分化為其他多種組織中成熟的非

6、造血細(xì)胞，如MSC已成功地定向誘導(dǎo)分化為中胚層細(xì)胞如成骨細(xì)胞[1]、脂肪細(xì)胞[2]、軟骨細(xì)胞[3]和肌腱細(xì)胞[4]等，還分化為外胚層細(xì)胞神經(jīng)細(xì)胞[5]，說明MSC可跨胚層分化。而有關(guān)MSC向表皮細(xì)胞分化的研究幾乎都是在體內(nèi)進(jìn)行，付小兵等把5-Brd標(biāo)記的MSC在體外擴(kuò)增后，回植入提供骨髓的香豬的皮內(nèi)和皮下，發(fā)現(xiàn)有5-Brd陽性標(biāo)記細(xì)胞出現(xiàn)在表皮的棘層和顆粒層，并表達(dá)角蛋白[6]，初步認(rèn)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)具有分化為表皮細(xì)胞的潛能。有

7、實驗表明，男性的骨髓移植給女性后，在女性受體表皮上發(fā)現(xiàn)有Y/cytokeratin陽性細(xì)胞[7、8、9].國外Korbling等取接受男性骨髓移植的女性受體的皮膚進(jìn)行活檢，用免疫組化和熒光原位雜交檢測發(fā)現(xiàn)有4％到14％的cytokeratin陽性細(xì)胞為Y陽性/角蛋白陽性的細(xì)胞，這些細(xì)胞不表達(dá)CD45，但在同一部位取材的表皮標(biāo)本，表皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)下，未發(fā)現(xiàn)有Y陽性的供體細(xì)胞[7].Herzog在研究中發(fā)現(xiàn)骨髓來源的MSCs能遷移至創(chuàng)口邊

8、緣，然后慢慢移至創(chuàng)口內(nèi)參與創(chuàng)面的愈合[10]。趙春華等把BALB/c小鼠(白毛)骨髓分離的干細(xì)胞輸入致死量照射的C57BL/6小鼠(黑毛)40天后，在受體小鼠的背上長出了白毛。經(jīng)免疫組化和RT-PCR證實受體小鼠皮膚干細(xì)胞來源于供體細(xì)胞[11]。以上資料說明MSC向表皮系細(xì)胞分化完全可能，但在體外誘導(dǎo)MSC向表皮細(xì)胞分化至今仍少見文獻(xiàn)報道。 研究目的 體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用特殊的誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)后，檢測其是否

9、表達(dá)表皮樣細(xì)胞標(biāo)記物，探索人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外向表皮樣細(xì)胞分化的可能性，為今后的研究奠定基礎(chǔ)。 材料和方法 取浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院和第二醫(yī)院檢查無造血系統(tǒng)惡性疾病的成人骨髓標(biāo)本共8例。按改良的Pittenger方法[12]，分離骨髓標(biāo)本，取單個核細(xì)胞培養(yǎng)傳代。待細(xì)胞傳代至第三代后，均分為對照組和實驗組，分別用完全培養(yǎng)基和特殊的誘導(dǎo)液培養(yǎng)。完全培養(yǎng)基即L-DMEM+10％FBS+100U/ml青鏈霉素雙抗；誘導(dǎo)液在完全

10、培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加20ng/mlEGF、10ug/mlInsulin、8ug/mlRetinoicAcid、16.65ug/mlCaCl2和20ng/mlbFGF。各培養(yǎng)10天。每天在相差顯微鏡下觀察誘導(dǎo)前后細(xì)胞的形態(tài)，用電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，免疫組化、流式細(xì)胞儀、RT-PCR和WesternBlot方法檢測誘導(dǎo)前后細(xì)胞角蛋白19(CK19)、P63、β1-integrin和廣譜角蛋白(pan-CK)的表達(dá)情況。 結(jié)果 1、

11、hMSCs的分離培養(yǎng)和擴(kuò)增Percoll分離液分離得到的單個核細(xì)胞24小時后貼壁，細(xì)胞呈呈紡錘形或長梭形，原代培養(yǎng)約7-15天可達(dá)到80-90％融合。傳代細(xì)胞24小時內(nèi)完全貼壁，1：3傳代，5-7天達(dá)到90％以上匯合。 2、HMSCs的形態(tài)觀察第3代細(xì)胞經(jīng)7天培養(yǎng)后，對照組細(xì)胞已達(dá)80％～90％的融合，細(xì)胞呈旋渦狀排列，實驗組細(xì)胞在相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞外形由長梭形轉(zhuǎn)變?yōu)楸鈭A形或不規(guī)則形，很少出現(xiàn)旋渦狀生長，成片狀或不規(guī)則狀生長

12、，增殖能力明顯減弱。透射電鏡發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間出現(xiàn)半橋粒連接，對照組中細(xì)胞間未見有半橋粒。 3、免疫組化檢測hMSCs的CK19、P63和pan-CK的表達(dá)免疫組化發(fā)現(xiàn)實驗組誘導(dǎo)后的hMSCs有部分細(xì)胞CK19和P63染色陽性，有少量細(xì)胞pan-CK染色陽性，對照組細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)有CK19、P63和pan-CK染色陽性細(xì)胞。 4、流式細(xì)胞儀檢測hMSCsP63和β1-integrin的表達(dá)對實驗組誘導(dǎo)后的hMSCs進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測

13、，發(fā)現(xiàn)有47.6％的P63表達(dá)陽性，對照組為陰性。β1-integrin陽性表達(dá)率都為99％，但熒光強度對照組為307.3，而實驗組為452.5，用配對T檢驗方法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.01。 5、RT-PCR檢測hMSCsCK19、P63和β1-integrinmRNA實驗組hMSCs表達(dá)CK19和P63，對照組為陰性。實驗組和對照組細(xì)胞均表達(dá)β1-integrin，用β-actin作內(nèi)參照，檢測發(fā)現(xiàn)實驗組條帶的光密度值是對照

14、組條帶的2.8倍。把CK19、P63和β1-integrin的PCR產(chǎn)物送去上海華諾生物公司進(jìn)行基因測序分析，測序結(jié)果和原基因序列基本完全符合。 6、WesternBlot檢測hMSCsCK19、P63和β1-integrin的表達(dá)實驗組hMSCs表達(dá)CK19和P63，對照組為陰性。實驗組和對照組均表達(dá)β1-integrin，用β-actin作內(nèi)參照，檢測發(fā)現(xiàn)實驗組的條帶比對照組明亮。 結(jié)論： hMSCs在體外能誘導(dǎo)分化