水稻基因聚合育種及cry1Ab基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的分子標記定位研究.pdf

1、水稻是世界上最重要的糧食作物之一,全球約二分之一的人口以稻米為主食,水稻也是受病蟲害最多的作物之一。由Xanthomonas oryzae pv.oryzae引起的水稻白葉枯病是世界范圍的細菌性病害,嚴重影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。水稻每年因鱗翅目害蟲(二化螟、三化螟、稻縱卷葉螟、稻螟蛉、稻苞蟲等)為害造成的損失占總產(chǎn)量的10％-30％。另外,雜交稻純度和稻田雜草影響水稻的產(chǎn)量與品質(zhì),使用除草劑費工費力,增加了生產(chǎn)成本,已成為生產(chǎn)上的主要問題

2、?？共?、抗蟲、抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻的培育為水稻的高產(chǎn)與穩(wěn)產(chǎn)提供重要保證的同時,可以減少化學農(nóng)藥的使用,改善環(huán)境質(zhì)量。實踐證明,將多個抗性基因聚合在同一水稻品種中能有效提高水稻的抗性和保持抗性持久,分子標記輔助選擇以其快速、準確的選擇優(yōu)勢成為實現(xiàn)基因聚合育種的有效手段。 對轉(zhuǎn)基因水稻中外源轉(zhuǎn)crylAb基因進行定位,構建轉(zhuǎn)crylAb基因水稻的分子遺傳圖譜,為轉(zhuǎn)crylAb基因水稻的培育進行標記輔助選擇提供更多的分子標記,同時為研究

3、轉(zhuǎn)crylAb基因水稻的基因組變化,進行轉(zhuǎn)基因水稻中外源基因的位置效應奠定基礎,為轉(zhuǎn)crylAb基因水稻生物安全性評價提供更多的理論支撐。 本論文主要開展了三個方面的研究：多抗性(抗白葉枯、螟蟲、除草劑)轉(zhuǎn)基因水稻恢復系的培育；水稻香味基因與抗白葉枯基因的分子標記聚合育種；轉(zhuǎn)基因水稻中轉(zhuǎn)crylAb基因的分子標記定位。主要研究結果如下： 1.多抗性(抗白葉枯、螟蟲、除草劑)轉(zhuǎn)基因水稻恢復系的培育 (1)將恢773

4、與攜有轉(zhuǎn)crylAb和bar基因的水稻新品系中國91(crylAb)雜交,并以恢773作為輪回親本,連續(xù)回交三代和自交一代,對各回交世代的單株進行crylAb和bar基因的PCR分析、田間抗蟲性鑒定和除草劑Basta抗性鑒定,經(jīng)過選擇獲得了轉(zhuǎn)基因水稻恢復系T773-1,田間種植對螟蟲及除草劑Basra表現(xiàn)很好的抗性。 (2)將恢773與帶有轉(zhuǎn)Xa21,基因的水稻新品系豫粳6(Xa21)雜交,并以恢773作為輪回親本,連續(xù)回交三代

5、和自交一代,經(jīng)過PCR分析、GUS活性測定和白葉枯病菌接種鑒定,在BC3F2代獲得帶有Xa21基因的并具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的轉(zhuǎn)基因水稻恢復系T773-2,田間種植表現(xiàn)很好的水稻白葉枯病抗性。 (3)轉(zhuǎn)crylAb和bar基因的水稻恢復系T773-1和轉(zhuǎn)Xa21基因的恢復系T773-2進行雜交、自交,對自交世代單株進行crylAb、bar和Xa21基因的分子標記輔助選擇,獲得了帶有三基因的恢復系T773,田間種植對水稻白葉枯病、鱗翅目

6、害蟲、除草劑具有很好的抗性。并利用恢復系T773與不育系早花2A進行雜交,進行配合力測定,獲得了抗白葉枯病、螟蟲與除草劑的多抗轉(zhuǎn)基因水稻恢復系T773。T773及其雜交后代的抗譜和抗性水平達到其抗性基因供體親本的水平,抗性改良效果明顯。 2.水稻香味基因與抗白葉枯基因的分子標記聚合育種 通過分子標記輔助選擇與傳統(tǒng)的雜交育種技術有機結合,將香稻栽培品種香粳9407與抗白葉枯病多基因聚合系IRBB60(Xa4、xa5、xa1

7、3、Xa21)進行雜交、自交,采用田間病原菌接種鑒定和香味鑒定篩選,結合農(nóng)藝性狀考查進行選擇,在自交F2代獲得兩個抗白葉枯基因和香味基因聚合系(2R+fgr)1株；在自交F3代獲得四個抗白葉枯基因和香味基因聚合系(4R+fgr)1株,三個抗白葉枯基因和香味基因聚合系(3R+fgr)2株,兩個抗白葉枯基因和香味基因聚合系(2R+fgr)7株,一個抗白葉枯基因和香味基因聚合系(1R+fgr)3株；在自交F4代獲得四個抗白葉枯基因和香味基因聚

8、合系(4R+fgr)10株,三個抗白葉枯基因和香味基因聚合系(3R+fgr)28株,兩個抗白葉枯基因和香味基因聚合系(2R+fgr)20株。獲得的多基因聚合系單株高抗水稻白葉枯病并且具有濃郁的香味,主要農(nóng)藝性狀優(yōu)良,可直接應用于抗白葉枯病香稻育種,對水稻抗性育種和品質(zhì)改良具有重要的實踐意義。 3.轉(zhuǎn)基因水稻中轉(zhuǎn)crylAb基因的分子標記定位 (1)首先利用純合穩(wěn)定的轉(zhuǎn)crylAb基因的水稻中國91與IRBB60雜交,對其

9、F2代分離群體的單株進行除草劑Basta抗性檢測,結果顯示,在F2代分離群體中crylAb基因的分離符合期望的3:1分離比例,遵循孟德爾分離規(guī)律,證明了crylAb基因在轉(zhuǎn)基因株系中以單顯性位點整合。 (2)利用Tail-PCR技術獲得轉(zhuǎn)基因水稻中外源crylAb基因插入的側翼序列,通過序列比較分析確定了轉(zhuǎn)cry1Ab基因在水稻基因組插入的物理位置。并根據(jù)插入位置附近的水稻基因組序列進行微衛(wèi)星序列的搜索,利用Primer Pre

10、mier 5.0軟件設計了24對SSR標記引物。 (3)利用設計的24對SSR引物對親本轉(zhuǎn)crylAb基因的水稻中國91與IRBB60之間進行多態(tài)性篩選,獲得了6對多態(tài)性引物,然后利用這6對引物以及引物RM1261對雜交的F2代分離群體240個單株進行分析。依據(jù)每個單株的基因型和表型數(shù)據(jù),利用MAPMAKER/EXP Version 3.0軟件進行分析,構建了外源轉(zhuǎn)基因crylAb在水稻第12染色體的遺傳圖譜,外源crylAb基