艾葉揮發(fā)油抗乙肝病毒活性研究及其化學(xué)成分分析.pdf

1、艾葉為菊科多年生草本植物艾(Artemisia argyi Lévl.et Vant.)的干燥葉，我國大部分地區(qū)都有分布。艾葉是我國歷史悠久的常用中藥，實(shí)驗(yàn)證明其具有抗菌抗病毒、平喘鎮(zhèn)咳祛痰、止血與抗凝血、抗過敏、鎮(zhèn)靜、免疫、抗自由基等藥理作用。艾葉抗乙肝病毒的活性、有效部位及有效部位化學(xué)成分研究未見報(bào)道。
　　 為了研究艾葉抗乙肝病毒有效部位新藥，本研究前期對(duì)艾葉不同極性提取部位進(jìn)行了抗乙肝病毒活性初步篩選，發(fā)現(xiàn)艾葉揮發(fā)油和乙

2、酸乙酯提取物對(duì)體外培養(yǎng)HepG2.2.15細(xì)胞分泌的HBsAg和HBeAg有抑制作用?；诖?，本課題進(jìn)行了艾葉揮發(fā)油抗乙肝病毒活性的體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)確證，利用正交試驗(yàn)法對(duì)揮發(fā)油提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。研究所用河南駐馬店產(chǎn)艾葉揮發(fā)油化學(xué)成分未見報(bào)道，鑒于環(huán)境和氣候條件的差別會(huì)對(duì)不同產(chǎn)地的艾葉揮發(fā)油化學(xué)成分有明顯的影響，從而影響其藥理活性，我們采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行了分析，進(jìn)一步明確了其抗乙肝病毒活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究為確定艾葉抗

3、乙肝病毒有效部位，對(duì)建立有效成分定性、定量質(zhì)控方法，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行艾葉抗乙肝病毒有效部位新藥的研制奠定了基礎(chǔ)。本課題完成如下研究工作:
　　 1、艾葉揮發(fā)油抗乙肝病毒活性的研究
　　 本課題首次對(duì)艾葉揮發(fā)油抗乙肝病毒活性進(jìn)行研究。將不同體積濃度艾葉揮發(fā)油作用于HepG2.2.15細(xì)胞，運(yùn)用MTT法檢測艾葉揮發(fā)油對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度(TC50)，酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)檢測其對(duì)HepG2.2.15

4、細(xì)胞分泌的表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)表達(dá)的抑制作用，以及熒光定量PCR法檢測艾葉揮發(fā)油對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBV-DNA拷貝數(shù)的影響。結(jié)果顯示艾葉揮發(fā)油對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞有一定毒性，半數(shù)毒性濃度(TC50)為0.069％，不同濃度的艾葉揮發(fā)油對(duì)HBsAg和HBeAg均有抑制作用，半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為0.009％、0.011％，對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBV-DNA也有抑制作用，IC50為0.0

5、14％，并呈劑量依賴性，艾葉揮發(fā)油第九天的治療指數(shù)為HBsAg7.7，HBeAg6.3，HBV-DNA4.9。體內(nèi)抗乙肝病毒實(shí)驗(yàn)采用雛鴨為動(dòng)物模型，艾葉揮發(fā)油高中低劑量組0.02 mL/(kg·d)、0.004 mL/(kg·d)、0.0008 mL/(kg·d)，灌胃給藥10 d，觀察用藥前(T0)與用藥后(T5、T10)及停藥后3d血清和肝臟中DHBV-DNA表達(dá)的抑制作用。結(jié)果表明艾葉揮發(fā)油對(duì)鴨血清和肝臟中DHBV-DNA有抑制作

6、用。
　　 2、艾葉揮發(fā)油提取工藝的優(yōu)化
　　 水蒸氣蒸餾法提取艾葉揮發(fā)油，采用正交試驗(yàn)法，以揮發(fā)油得率為考察指標(biāo)，提取時(shí)間(A)、料液比(B)、浸泡時(shí)間(C)為考察因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，對(duì)艾葉揮發(fā)油的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。得艾葉揮發(fā)油最佳提取工藝為:料液比1∶10，浸泡4h，蒸餾3h。
　　 3、艾葉揮發(fā)油的GC-MS分析
　　 本研究首次對(duì)河南駐馬店產(chǎn)艾葉揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行分析。應(yīng)用GC-MS對(duì)其分離

7、鑒定，歸一化法測定其相對(duì)含量。檢出103個(gè)色譜峰，鑒定了69個(gè)化合物，占揮發(fā)油色譜峰總面積的96.01％，其中(Z)-3-甲基-2-（2-戊烯基）-2-環(huán)戊烯-1-酮（茉莉酮）和4-(2，6，6-三甲基-1-環(huán)己烯基)-3-丁烯-2-酮（β-紫羅酮）在艾葉揮發(fā)油中首次報(bào)道。河南駐馬店產(chǎn)艾葉揮發(fā)油的主要成分為1，8-桉葉油素(28.59％)、龍腦(7.94％)、4-甲基-1-(1-甲乙基)-3-環(huán)己烯-1-醇(6.56％)、3，3，6-三