艾葉乙酸乙酯提取物不同極性部位抗乙肝病毒活性篩選及成分分析.pdf

1、艾葉為菊科多年生植物艾Artemisia argyi level.et Vant.的干燥葉，是臨床常用的中藥。文獻報道:艾葉的主要化學成分包括揮發(fā)油、黃酮類、甾醇類、萜類、色原酮類和微量元素等;艾葉具有理氣血、逐寒濕、溫經(jīng)血、止痛等功用;現(xiàn)代研究證實，艾葉具有鎮(zhèn)咳、平喘、祛痰、抗菌、抗病毒、抗過敏、抗癌、增強免疫等多種藥理作用。艾葉抗乙肝病毒活性及抗乙肝病毒有效部位研究未見報道。本課題組經(jīng)體內(nèi)外實驗研究發(fā)現(xiàn)艾葉揮發(fā)油和乙酸乙酯提取物具有

2、抗乙肝病毒活性，有關研究內(nèi)容獲國家發(fā)明專利，為研制艾葉抗乙肝病毒有效部位新藥，本文在前期研究基礎上對艾葉乙酸乙酯提取物的不同極性部位進行抗乙肝病毒活性的進一步篩選，并對其化學成分進行了分析。
　　艾葉乙酸乙酯提取物不同極性部位的制備。首先是艾葉乙酸乙酯提取物的制備。稱取粉碎的艾葉約1Kg，水蒸汽蒸餾法提取揮發(fā)油，得艾葉揮發(fā)油和水提取液。藥渣依次用石油醚、乙酸乙酯、乙醇回流提取，各回流提取兩次，每次2h，所得提取液分別合并后濃縮、水

3、浴蒸干、真空干燥，其中得乙酸乙酯浸膏20.6g。其次，依次用石油醚、石油醚-乙酸乙酯(1∶1，V∶V)、60％乙醇對艾葉乙酸乙酯浸膏進行回流提取，得艾葉乙酸乙酯提取物不同極性部位:石油醚部位(EA-1)5.4g、石油醚-乙酸乙酯(1∶1，V∶V)部位（EA-2）2.8g、60％乙醇部位(EA-3)2.4g和乙酸乙酯部位(EA-4)2.5g。
　　艾葉乙酸乙酯提取物不同極性部位體外抗乙肝病毒實驗。本實驗選用抗乙肝病毒體外實驗常用的H

4、epG2.2.15細胞為細胞模型，對艾葉乙酸乙酯提取物的四個不同極性部位EA-1、EA-2、EA-3和EA-4進行藥理活性篩選。
　　1.采用MTT比色法，觀察EA-1、EA-2、EA-3和EA-4對HepG2.2.15細胞的毒性作用。結(jié)果表明，EA-1、EA-2、EA-3和EA-4對HepG2.2.15細胞的毒性作用均較低，安全性較高。其中EA-1和EA-3半數(shù)毒性濃度(TC50)分別為217.3μg·mL-1和112.4μg·

5、mL-1，EA-2和EA-4均大于200μg·mL-1。
　　2.利用ELISA法，檢測EA-1、EA-2、EA-3和EA-4對細胞上清液中HBeAg和HBsAg的影響。結(jié)果表明EA-1、EA-2、EA-3和EA-4的三個濃度組均對HBsAg和HBeAg有抑制作用，呈劑量依賴性，其對HBsAg和HBeAg的半數(shù)抑制濃度(IC50)依次為:2.63μg·mL-1和7.33μgnL-1;7.57μg·mL-1和16.34μg·mL-1

6、;3.67μg·mL-1和18.98μg·mL-1;,16.88μg·mL-1和31.42μg·mL-1。
　　3.用熒光定量PCR法測定EA-1、EA-2、EA-3和EA-4對細胞上清液和細胞內(nèi)的HBVDNA拷貝數(shù)的影響。結(jié)果表明，四個部位對HepG2.2.15細胞HBVDNA均有抑制作用，并呈劑量依賴關系，但抑制效果不及拉米夫定(3TC)。其中EA-1對細胞上清的HBVDNA的半數(shù)抑制濃度為39.18μg·mL-1，其他三個部

7、位的抑制能力則較弱。
　　EA-1第九天治療指數(shù)為HBsAg82.6，HBeAg29.6，細胞上清HBVDNA6.8;EA-3第九天治療指數(shù)為HBsAg30.6，HBeAg5.9。綜合各部位對細胞上清液中HbeAg、HbsAg以及細胞上清液和細胞內(nèi)的HBVDNA拷貝數(shù)的影響情況，EA-1、EA-2、EA-3和EA-4均具有抗乙肝病毒活性，其中EA-1和EA-3活性較強。
　　對抗乙肝病毒活性較強的EA-1和EA-3兩個部位進

8、行了化學成分的初步分析。
　　1.采用硅膠柱層析分離、重結(jié)晶純化，分離得到5個單體化合物，分別為FAA20120831A、FAA20130430A、FAA20130430B、FAA20130430C和FAA20130430D，其中FAA20130430A和FAA20130430C為同一物質(zhì)，F(xiàn)AA20130430D與前期分離得到的FAA20120313F為同一物質(zhì)，為3'-甲氧基薊黃素（5，4'-二羥基-6，7，3'-三甲氧基黃酮

9、）。
　　2.采用TLC自身高(100μg)、低(1μg)濃度對照法，三種不同溶劑系統(tǒng)展開，以及HPLC法對FAA20120831A，F(xiàn)AA20130430B、FAA20130430C進行純度判定。通過TLC鑒定，F(xiàn)AA20120831A、FAA20130430B和FAA20130430C的純度均大于99％。用HPLC法對FAA20130430B純度進行了進一步研究，未發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)。由于FAA20120831A和FAA20130430

10、C的紫外吸收弱，沒有用HPLC法分析其純度。
　　3.運用核磁共振氫譜、碳譜、二維核磁共振(DEPT、HMBC、HSQC、1H，1H-COSY)譜圖等數(shù)掘并結(jié)合文獻對FAA20120831A、FAA20130430B和FAA20130430C進行分析，F(xiàn)AA20120831A、FAA20130430B分別為達瑪二烯醇乙酸酯、5，7，4'-三羥基-3'，8-二甲氧基黃酮，F(xiàn)AA20130430C可能為十六烷酸丙酯?；衔镞_瑪二烯醇乙