人TIM-3基因的克隆及其真核表達(dá).pdf

1、背景與目的：
　　 CD4+效應(yīng)性T細(xì)胞按其細(xì)胞因子的產(chǎn)生模式可分為T(mén)h1和Th2兩種類(lèi)型。Th1和Th2細(xì)胞在機(jī)體免疫中起不同的作用。Th1型細(xì)胞主要介導(dǎo)針對(duì)細(xì)胞內(nèi)病原體如細(xì)菌、病毒感染引起的細(xì)胞免疫,Th2型細(xì)胞主要介導(dǎo)體液免疫和過(guò)敏反應(yīng)等。T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)分子(T-cell immunoglobulin andmucin-domain-containing molecule,Tim)是新近發(fā)現(xiàn)在T細(xì)胞表面的

2、跨膜蛋白家族,它對(duì)輔助性T細(xì)胞(Th1和Th2)的分化和調(diào)控起著重要作用。其中Tim-3是Tim家族中的一個(gè)重要的成員,它是終末分化的Th1細(xì)胞表面標(biāo)志,不表達(dá)于初始T細(xì)胞、B細(xì)胞。Tim-3與Tim-3配體(galectin-9)結(jié)合從而下調(diào)Th1型免疫應(yīng)答,進(jìn)而推測(cè)Tim-3可以通過(guò)調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞反應(yīng),從而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能。但近年研究表明Tim-3除了在Th1細(xì)胞上表達(dá)外,還在Th17細(xì)胞、Treg、單核巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹(shù)突狀

3、細(xì)胞、肥大細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞上表達(dá)。Tim-3在這些細(xì)胞中表達(dá)的作用各有差異,提示Tim-3除了調(diào)節(jié)Th免疫反應(yīng)外可能還具有多種生物學(xué)作用,但是其確切作用尚不清楚。為此,本文從人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中用RT-PCR的方法擴(kuò)增出人Tim-3 cDNA,構(gòu)建出人Tim-3的真核表達(dá)載體。并觀察了其在肝癌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的表達(dá),為后續(xù)研究進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能并最終應(yīng)用于臨床基因治療奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 ①獲

4、得健康人外周血的單個(gè)核細(xì)胞并克隆人Tim-3基因:取健康人外周血3ml,用淋巴細(xì)胞分離液分離出PBMC。獲得人Tim-3基因:提取PBMC的總RNA,再逆轉(zhuǎn)成cDNA,PCR法獲取帶酶切位點(diǎn)的人Tim-3基因。
　　 ②人Tim-3基因的亞克隆:帶有A尾的PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T載體上,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)大腸桿菌DH5a,菌液涂布在含Amp、X-gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)16～24h出現(xiàn)藍(lán)白斑菌落,挑取

5、白斑單克隆菌落放入含Amp的LB液體培養(yǎng)基中搖菌,提取質(zhì)粒,PCR、酶切和測(cè)序鑒定是否為人Tim-3基因。
　　 ③構(gòu)建人Tim-3基因真核表達(dá)質(zhì)粒:雙酶切后的pEGFP-N1真核表達(dá)載體和從pGEMT-T-Tim-3重組質(zhì)粒中雙酶切下的Tim-3基因連接過(guò)夜,轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)大腸桿菌DH5a,菌液涂布在含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上,培養(yǎng)16～24h出現(xiàn)單克隆菌,挑取單克隆菌,在含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增大腸桿菌,提取質(zhì)粒,最

6、后PCR、酶切和測(cè)序鑒定是否為人Tim-3基因。
　　 ④肝癌細(xì)胞SMMC7721和巨噬細(xì)胞U937培養(yǎng):加有10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)細(xì)胞,隔天換液,細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶90％時(shí)傳代培養(yǎng)。
　　 ⑤Tim-3基因真核表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染:pEGFP-N1-Tim-3真核表達(dá)質(zhì)粒溶液和脂質(zhì)體溶液孵育后轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞SMMC7721和巨噬細(xì)胞U937中。熒光顯微鏡觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后綠色熒光表達(dá)情況,初步判斷轉(zhuǎn)染效率。

7、　　 結(jié)果：
　　 ①利用RT-PCR技術(shù)從正常健康成年人外周血單個(gè)核細(xì)胞中擴(kuò)增出了Tim-3基因,瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)核酸大小與預(yù)計(jì)一致,并成功構(gòu)建了Tim-3基因的重組質(zhì)粒pGEM-T-Tim-3。測(cè)序結(jié)果證實(shí)Tim-3基因完整無(wú)誤的正向單倍插入到pGEM-T載體中。
　　 ②成功構(gòu)建了pEGFP-N1-Tim-3重組質(zhì)粒,測(cè)序分析顯示Tim-3序列為完整無(wú)誤正向、單倍的插入,插入片段與PubMed基因文庫(kù)(GenB

8、ank accessNM032782.3)中的Tim-3基因序列的相似性為100％。
　　 ③重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Tim-3成功轉(zhuǎn)染進(jìn)肝癌細(xì)胞SMMC7721和巨噬細(xì)胞U937中,RT-PCR結(jié)果顯示融合基因能有效轉(zhuǎn)錄,熒光顯微鏡下成功觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá),且綠色熒光蛋白定位于肝癌細(xì)胞SMMC7721和巨噬細(xì)胞U937的細(xì)胞膜上,進(jìn)一步證實(shí)了Tim-3蛋白為細(xì)胞膜蛋白。
　　 結(jié)論：
　　 ①本研究用R

9、T-PCR方法,以健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞為模板,擴(kuò)增出Tim-3基因,亞克隆至pGEM-T載體,成功構(gòu)建pGEM-T-Tim-3重組質(zhì)粒。
　　 ②將pGEM-T-Tim-3重組質(zhì)粒酶切下帶有限制性酶切位點(diǎn)的Tim-3基因和雙酶切后的pEGFP-N1表達(dá)載體連接,成功構(gòu)建出pEGFP-N1-Tim-3真核表達(dá)質(zhì)粒。
　　 ③RT-PCR結(jié)果顯示融合基因能有效轉(zhuǎn)錄,熒光顯微鏡下清晰顯示出目的蛋白定位于肝癌細(xì)胞SMMC772