食源性致病菌高通量懸浮芯片檢測技術(shù)研究.pdf

1、食源性致病菌的污染不僅在世界范圍內(nèi)危害巨大,而且也嚴(yán)重影響我國進(jìn)出口貿(mào)易,而致病菌的傳統(tǒng)檢測技術(shù)工作流程長、自動化水平低,難以適應(yīng)快速檢測的實(shí)際需求,其他常用的檢測方法又不能夠滿足多元檢測的要求?；诖?本研究旨在應(yīng)用高通量懸浮芯片技術(shù),以六種常見的食源性致病菌包括大腸桿菌O157:H7、志賀氏菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌和單核增生李斯特菌為檢測靶標(biāo)物,建立一種新型快速、靈敏、高通量的檢測方法,以彌補(bǔ)現(xiàn)有方法不足,實(shí)現(xiàn)對食

2、品中致病菌的快速、準(zhǔn)確和高效多元檢測,進(jìn)一步完善高通量懸浮芯片食品安全檢測技術(shù)平臺。
　　本研究以幾種常見的食源性致病菌為靶標(biāo)物,基于核酸特異識別和抗體特異識別的原理,實(shí)現(xiàn)了對多種致病菌靶標(biāo)物的同時(shí)多元檢測;通過對檢測過程的優(yōu)化和摸索實(shí)驗(yàn)條件,進(jìn)一步提高了懸浮芯片檢測的靈敏度、穩(wěn)定性;通過與PCR檢測方法和雙抗夾心ELISA法的比對實(shí)驗(yàn),確定了懸浮芯片法檢測的準(zhǔn)確性,與常規(guī)檢測方法相比,懸浮芯片法檢測簡便、快捷,操作簡單,結(jié)果重復(fù)

3、性高,穩(wěn)定可靠。
　　本研究的研究內(nèi)容主要包括以下幾個(gè)方面:
　　1、基于致病菌16SrDNA的懸浮芯片多重檢測
　　以四種常見的食源性致病菌大腸桿菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌和金黃色葡萄球菌為靶標(biāo)物,以16SrRNA為靶基因,分別設(shè)計(jì)基于上述四種目標(biāo)物的特異性引物及探針,將設(shè)計(jì)的探針與羧基化的聚苯乙烯微球偶聯(lián),特異性地捕獲PCR擴(kuò)增片段,從而達(dá)到檢測目標(biāo)菌的目的。
　　對懸浮芯片檢測致病菌核酸的探針特異性及最佳雜

4、交溫度進(jìn)行了優(yōu)化,經(jīng)探針特異性驗(yàn)證,所設(shè)計(jì)探針特異性較好,無明顯交叉反應(yīng);對偶聯(lián)探針的微球與目標(biāo)物雜交溫度條件進(jìn)行了摸索,確定最佳雜交溫度為42℃。同時(shí)還對單通道和多通道檢測探針的靈敏度進(jìn)行了驗(yàn)證,最終單通道檢測探針靈敏度結(jié)果如下:大腸桿菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌為5×10-6mmol/L,金黃色葡萄球菌為5×10-5mmol/L,多通道檢測探針的靈敏度結(jié)果如下:大腸桿菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌和金黃色葡萄球菌均為1.25×10-4mm

5、ol/L。優(yōu)化了多重PCR檢測的樣品加入量,加入15μl多重?cái)U(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生的熒光信號與單一PCR產(chǎn)物的熒光信號大致相當(dāng)。將四種致病菌計(jì)數(shù)后分別添加到四種蔬菜中,利用懸浮芯片檢測,結(jié)果表明大腸桿菌在油菜中的檢測限和副溶血性弧菌在生菜中的檢出限均為103CFU/ml,沙門氏菌在黃瓜中和金黃色葡萄球菌在辣椒中的檢出限為100CFU/ml。
　　2、基于致病菌特有基因的懸浮芯片多重檢測
　　針對大腸桿菌O157:H7、志賀氏菌、沙門氏

6、菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌和單核增生李斯特菌的各自特有基因,設(shè)計(jì)引物,在引物擴(kuò)增區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)能夠區(qū)別其他菌株的特異性探針,通過探針特異性驗(yàn)證、探針靈敏度實(shí)驗(yàn)、方法特異性實(shí)驗(yàn)等證明該方法可以特異性的檢測六種致病菌,與常規(guī)PCR方法比較,檢測靈敏度明顯高于常規(guī)方法,多通道檢測探針靈敏度為1.6×10-6mmol/L,對單一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測最低檢出限為20-4×103CFU/ml,多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測最低檢出限為1-10CFU/ml

7、,不僅可以滿足日常食品安全檢測的要求,甚至可以滿足臨床樣品的檢測要求。
　　3、基于雙抗夾心法的致病菌免疫懸浮芯片檢測技術(shù)研究
　　分別制備了志賀氏菌、沙門氏菌和單核增生李斯特菌的多克隆抗體并生物素標(biāo)記;建立了病原體蛋白懸浮芯片定量檢測方法;優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)的條件;討論了方法的特異性、靈敏度、檢測范圍、定量檢測能力,并與臨床常用的雙抗夾心ELISA方法進(jìn)行了系統(tǒng)地對比。
　　本研究通過建立高通量致病菌檢測的懸浮芯片技術(shù),通過