北玄參組織培養(yǎng)及毛狀根培養(yǎng)體系的建立.pdf

1、北玄參（Scrphulariabuergeriana）為玄參科玄參屬草本植物，是重要的傳統(tǒng)藥材。在中國北方一直以來用北玄參替代玄參入藥，有悠久的入藥歷史。本研究首先對北玄參種子進行不同的消毒處理，獲得無菌苗，統(tǒng)計種子的萌發(fā)率和污染率，建立北玄參的無菌體系。然后分別以莖段、葉柄、葉片為外植體，采用正交設(shè)計，研究不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比的培養(yǎng)基誘導(dǎo)北玄參愈傷組織、不定芽和生根培養(yǎng)，篩選北玄參組織培養(yǎng)各階段最佳培養(yǎng)基組成，同時建立了北玄參的高頻

2、再生體系。本研究還開展了4種發(fā)根農(nóng)桿菌對北玄參遺傳轉(zhuǎn)化條件的研究，建立了北玄參的毛狀根培養(yǎng)體系。通過以上研究，結(jié)果如下：
　　1北玄參種子比較小，消毒處理比較困難。研究認(rèn)為直接用0.1％HgCl2滅菌6 min就能達到良好的消毒效果，污染率為4.95%，種子萌發(fā)率為81.49%；種子萌發(fā)均勻，種苗發(fā)育正常，生長狀態(tài)良好。
　　2北玄參無性快繁體系建立以北玄參無菌苗的莖段、葉柄、葉片為試材，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織和不定芽，進而誘導(dǎo)不

3、定根的分化，建立了北玄參的高頻再生體系。通過正交設(shè)計，適合北玄參離體再生的外植體依次為葉片＞葉柄＞莖段；誘導(dǎo)外植體再生不定芽最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg.L-1+NAA0.2 mg.L-1，誘導(dǎo)率可達100%，芽增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA0.2mg.L-1+NAA0.2 mg.L-1，增殖倍數(shù)為9.13；誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基為1/4 MS+IBA0.2mg.L-1，生根率100%，平均生根數(shù)為11.33；再生植株移栽的成活率為86.

4、96%。
　　3北玄參毛狀根培養(yǎng)體系的建立以發(fā)根農(nóng)桿菌 A4、R1601、C58C1和ATCC15834這4種菌株進行侵染得到毛狀根，根據(jù)誘導(dǎo)率的高低，得出最適合誘導(dǎo)北玄參毛狀根的農(nóng)桿菌是A4、R1601菌株。對外植體（葉片、葉柄、莖段）進行篩選，得出幼嫩的葉片較成熟的葉片作為實驗材料比較合適。北玄參毛狀根誘導(dǎo)的條件是：預(yù)培養(yǎng)2-3d，外植體侵染的時間為10-12min，共培養(yǎng)天數(shù)為2-3d，最高誘導(dǎo)率可達到90.01%。乙酰丁香

5、酮能夠促進發(fā)根農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化，提高北玄參葉片毛狀根的誘導(dǎo)率。AS的濃度為100μmol/L時，其誘導(dǎo)率最高為90.01%，是濃度過高，對外植體葉片的傷害較大，后期外植體很容易褐化，從而降低了毛狀根的誘導(dǎo)率。1/2MS液體培養(yǎng)基較有利于北玄參毛狀根的生長，在培養(yǎng)基中鮮重增加倍數(shù)最多可達到13.5倍。毛狀根 PCR檢測結(jié)果證明，Ri質(zhì)粒的T-DNA已整合到北玄參毛狀根基因組中。
　　4北玄參毛狀根在 MS＋6-BA0.5mg/L+NAA