維生素C兩步發(fā)酵中關(guān)鍵酶的研究.pdf

1、我國(guó)首創(chuàng)的VC兩步發(fā)酵法是惟一應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)VC微生物轉(zhuǎn)化法，其第一步為醇糖轉(zhuǎn)化，由葡糖桿菌(俗稱一步菌)將D-山梨醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-山梨糖；第二步為糖酸轉(zhuǎn)化，由普通生酮基古龍酸菌(俗稱小菌)與其伴生菌(俗稱大菌)的混合菌系將L-山梨糖轉(zhuǎn)化為VC前體2-酮基-L-古龍酸(2-KGA)。兩步發(fā)酵法的糖酸轉(zhuǎn)化效率很高，但需要兩步發(fā)酵，三種微生物共同參與。若能應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)將參與兩步發(fā)酵的相關(guān)基因整合在單一宿主菌中表達(dá)，構(gòu)建一步發(fā)酵工程菌，

2、可簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝、提高工藝穩(wěn)定性、節(jié)省生產(chǎn)成本，從而提升我國(guó)VC產(chǎn)業(yè)的競(jìng)爭(zhēng)力和科技地位。本研究從VC生產(chǎn)菌株中分離轉(zhuǎn)化的相關(guān)基因，為一步菌的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。 本課題組已從小菌基因文庫(kù)中分離得到了一種山梨糖脫氫酶基因(sdh)，其表達(dá)產(chǎn)物山梨糖脫氫酶(SDH)能在體外將L-山梨糖轉(zhuǎn)化為2-KGA，但在大腸桿菌體內(nèi)卻不能完成轉(zhuǎn)化。本研究試圖通過轉(zhuǎn)座誘變和突變基因分析篩選VC兩步發(fā)酵菌中醇糖和糖酸轉(zhuǎn)化的其他相關(guān)基因。 利用Tn5轉(zhuǎn)

3、座系統(tǒng)對(duì)酮古龍酸菌SCB329進(jìn)行了誘變，篩選不能進(jìn)行糖酸轉(zhuǎn)化的突變株。從750株SCB329突變株中得到1株不產(chǎn)酸的變株，該突變株可望用于研究糖酸轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化機(jī)制或?qū)ふ蚁嚓P(guān)基因。建立了葡糖桿菌的Tn5誘變系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了Tn5轉(zhuǎn)座對(duì)葡糖桿菌的誘變，為葡糖桿菌山梨醇代謝途徑研究及相關(guān)基因分離奠定了基礎(chǔ)。 利用SOLEXA技術(shù)對(duì)酮古龍酸菌SCB329進(jìn)行全基因組分析，測(cè)序結(jié)果通過軟件分析和數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，預(yù)測(cè)得到了基因組上山梨糖脫氫酶的開放閱

4、讀框。從SCB329基因組上擴(kuò)增出7個(gè)可能的山梨糖脫氫酶的基因編碼框，并連接入帶有小菌啟動(dòng)子的表達(dá)載體pBMP3上，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。經(jīng)活性染色、體外轉(zhuǎn)化反應(yīng)等方法考察表達(dá)產(chǎn)物的活性，發(fā)現(xiàn)其中1個(gè)讀框的表達(dá)產(chǎn)物具有山梨糖脫氫酶活性。該基因編碼579個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，pI為4.15，其生物活性嚴(yán)格依賴PQQ，能夠催化多種含羥基及羰基化合物脫氫，并能在體外將L-山梨糖直接轉(zhuǎn)化為2-KGA。根據(jù)該蛋白的上述特性，將其命名為醇醛脫氫酶