尼羅羅非魚兩種relaxin3基因的克隆、表達(dá)與功能研究.pdf

1、松弛素家族是一類小分子的多肽激素，在脊椎動(dòng)物的研究過程中，發(fā)現(xiàn)了松弛素家族共有7個(gè)家族成員，分別是:RLN1，RLN2，RLN3，INSL3，INSL4，INSL5和INSL6，他們?cè)诓溉閯?dòng)物的許多生理活動(dòng)中具有重要的作用，例如在婦女妊娠期間能夠抑制子宮肌的收縮以有利于妊娠，改善心血管，滲透壓的調(diào)控以及能夠促進(jìn)生殖組織的生長和發(fā)育。松弛素3(Relaxin3; RLN3)是一種新型的松弛素家族成員，在哺乳動(dòng)物中，松弛素3參與調(diào)控哺乳動(dòng)物

2、的記憶，食欲，壓力應(yīng)激，認(rèn)知能力，滲透壓，大腦的焦慮等生理活動(dòng)。在硬骨魚類尼羅羅非魚中，通過共線性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析得到了兩種rln3的同源基因rln3a和nrln3b，這兩種同源基因的出現(xiàn)是在魚類特有的一次基因組復(fù)制中產(chǎn)生的。但是在硬骨魚類中，這兩種rln3基因的作用機(jī)制幾乎沒有報(bào)道，對(duì)這兩種rln3基因的功能所知甚少！尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)是世界上重要的養(yǎng)殖魚類，其性別決定類型為XX/XY型。由于

3、其容易獲得單一性狀的魚苗以及他們的全部基因組已經(jīng)測序完成并公開，所以尼羅羅非魚已經(jīng)成為研究硬骨魚類性生殖與發(fā)育良好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。本研究主要通過RT-PCR和Real-time PCR發(fā)現(xiàn)了兩種rln3的表達(dá)模式:rln3a主要表達(dá)在尼羅羅非魚的精巢而rln3b主要分布于腦中。又通過基因敲除方法發(fā)現(xiàn)rln3a在尼羅羅非魚性別方面的功能以及rln3b在尼羅羅非魚滲透壓方面的作用，主要研究結(jié)果如下:
　　1)從尼羅羅非魚的成魚精巢中分離了

4、兩種rln3基因:rln3a和rln3b，他們的ORF全長分別為444 bp和456bp，編碼的蛋白質(zhì)分別為147和151個(gè)氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，硬骨魚類的rln3基因和四足動(dòng)物和腔棘魚形成了不同的進(jìn)化樹分支。然而有趣的是，通過共線性發(fā)現(xiàn)rln3b，和四足動(dòng)物的rln3是直系同源基因，因?yàn)閞ln3b的共線性上的基因CC2DL1A and NANOS3和四足動(dòng)物的共線，而在rln3a上并沒有這些基因。
　　2)通過Real-t

5、ime PCR可以發(fā)現(xiàn)尼羅羅非魚的rln3a在精巢，腦，垂體和腎臟中表達(dá)，但主要表達(dá)在精巢。Rln3b在腦和其他地方，例如垂體和精巢中表達(dá)，但是在腦中的表達(dá)量最高。通過Real-time方法，發(fā)現(xiàn)在性腺中rln3a只表達(dá)在尼羅羅非魚的精巢中，在卵巢中基本不表達(dá)，而且是各個(gè)時(shí)期表達(dá)量都很低，基本都保持在本底水平。Rln3a在精巢中的表達(dá)量從30天開始升高，在90d進(jìn)一步升高，到150d達(dá)到最高值，之后一直保持在最高水平。而rln3b在精巢

6、中的表達(dá)量升高的比較晚，直至150d才開始上升，而它在卵巢中表達(dá)量也很低，保持在本底水平。
　　3)利用CRISPR/Cas9靶向基因敲除技術(shù)在羅非魚XY個(gè)體成功敲除rln3a基因，組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn):在3個(gè)月和5月齡的rln3a突變個(gè)體中，與對(duì)照組相比，精母細(xì)胞和精子生成受阻。特別是在90天的陽性突變r(jià)ln3a魚中，精原細(xì)胞的增殖受阻，基本觀察不到精原細(xì)胞的生成。一直持續(xù)到150天，精原細(xì)胞的增殖和精子的生成慢慢恢復(fù)，但是恢復(fù)不完全

7、。在240天檢測突變陽性魚，才基本恢復(fù)。免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn):在90天時(shí)候，rln3a突變魚與正常對(duì)照組相比，精原細(xì)胞的標(biāo)記基因Vasa基因和Ef1alb基因都檢測不到，說明突變組基本沒有精原細(xì)胞的生成，這與組織學(xué)觀察到的結(jié)果一致。直到150天，rln3a突變組的精原細(xì)胞開始慢慢出現(xiàn)，精子生成也開始慢慢恢復(fù)，在部分突變魚的精巢中可以檢測到Vasa和Ef1a1b基因的表達(dá)，而在部分突變魚精巢中仍然檢測不到Vasa和Ef1a1b基因的表達(dá)，

8、也沒有觀察到精原細(xì)胞和精子的生成。而在240天時(shí)，rln3a突變魚的精子發(fā)生已經(jīng)基本恢復(fù)，即有精原細(xì)胞的生成，又有減數(shù)分裂和精子的生成。
　　4)為了檢測rln3a和rln3b在尼羅羅非魚滲透壓方面的功能，分別用不同鹽度和不同時(shí)間組處理正常尼羅羅非魚，然后取其腦組織，提取RNA，做Real-timePCR檢測rln3a和rln3b的變化情況，檢測結(jié)果:rln3b在處理4天后，在8ppt濃度的Nacl中和對(duì)照組與20ppt濃度的Na

9、cl表達(dá)升高，而在在20ppt濃度的Nacl中的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，并且有顯著性差異，而在處理8天后，對(duì)照組，8ppt濃度的Nacl組和20ppt濃度的Nacl組，rln3b的表達(dá)量逐次升高，且都有明顯的差異性，說明rln3b隨著Nacl濃度的升高，其表達(dá)量也升高。而在處理的8ppt濃度的Nacl組和處理的20ppt濃度的Nacl組，rln3b的表達(dá)量都是隨著時(shí)間的變化逐漸升高，也具有明顯的差異性，這說明rln3b隨著時(shí)間的推移，其表