性類固醇激素對尼羅羅非魚雌雄生長差異與生長相關(guān)基因表達的影響.pdf

1、因為具有生長快、食性雜和適應(yīng)性強等特點，羅非魚已成為世界重要養(yǎng)殖魚類。其雌雄生長差異明顯，雄性生長快、個體大，而雌性生長慢、個體??；性成熟前雄魚較雌魚生長快，性成熟后更加明顯，部分原因可能性有：性類固醇激素水平、生長與生殖能量配置、攝食消化等差異。本論文以尼羅羅非魚為實驗對象，首先比較了性成熟前雌雄魚生長特征與性類固醇激素分泌水平關(guān)系；通過體外注射性類固醇激素，分別研究了性類固醇激素對生長軸相關(guān)基因、生肌因子、攝食基因的表達調(diào)節(jié)影響；最

2、后比較了雌雄魚性類固醇激素受體表達差異，旨在為羅非魚雌雄性別生長差異的調(diào)節(jié)機理研究提供資料，主要結(jié)果如下：
　　（1）利用分子標記法、醋酸洋紅壓片法、組織切片技術(shù)等方法進行個體性別鑒定，比較了性成熟前期（0.5～4月齡）尼羅羅非魚雌、雄魚生長差異，并檢測了2.5～4.0月齡雌、雄魚血清睪酮（T）、雌二醇（E2）激素含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雌、雄魚全長、體重分別自3.0月齡、2.5月齡開始出現(xiàn)差異顯著。Logistic擬合全長、體重生長方程

3、為： Lt(♀)=16.443/(1+e(2.821-1.363*t))， Lt(♂)=18.248/(1+e(2.752-1.295*t))；Wt(♀)=107.704/(1+e(5.157-1.464*t)，Wt(♂)=134.796/(1+e(5.080-1.417*t)，雌、雄魚全長、體重的擬合度R2均大于0.94，擬合效果均較好。隨著月齡增加，雌、雄魚全長、體重差異逐漸增大，全長生長速度最大時月齡為2.069和2.125，全長

4、生長曲線不具拐點，隨著月齡的增加，逐漸趨向漸進值；體重的拐點月齡為3.523和3.585，拐點體重值為52.352g和67.398g，雄魚體重拐點月齡與拐點體重值均大于雌魚。對Logistic方程求一階導(dǎo)數(shù)和二階導(dǎo)數(shù)，分別得雌、雄魚生長速度、生長加速度。雌、雄魚的全長、體重生長速度均是先上升后下降，隨著生長發(fā)育，雌、雄魚體重差異逐漸增大，體重生長速度的差異也逐漸增大。雌、雄魚全長、體重生長加速度變化規(guī)律類似，呈上升-下降-再上升趨勢。在

5、全長生長速度最大時，加速度為零，此后為負值，生長速度減小。體重生長加速度的最大值和最小值（兩個極值）分別對應(yīng)始速點和終速點，相應(yīng)分為三個時期：緩慢生長期、快速生長期和漸進生長期，雌魚進入快速生長期的始速點（2.623月齡）和終速點（4.422月齡）都比雄魚（2.655月齡，4.514月齡）提前，雄魚快速增長期的凈增長量（77.831g）和快速增長期持續(xù)時間（1.859月）大于雌魚（1.799g，60.525月），雄魚體重增加顯著大于雌魚

6、。2.5月齡之后，雌、雄魚E2含量差異顯著，3月齡之后，雌、雄魚T含量差異顯著，雄魚雄激素水平高、雌激素水平低，生長更快；而雌魚雄激素水平相對低，雌激素水平高，生長較慢，這可能與雌、雄魚在性腺發(fā)育過程中進行的生殖投入不同有關(guān)。推測E2、T含量差異是引起尼羅羅非魚雌雄性別生長差異的原因之一。
　　（2）采用體外注射雌二醇、睪酮的方法結(jié)合熒光定量PCR方法，比較了E2和T對雌雄尼羅羅非魚的生長、攝食、血清性類固醇激素水平、肝臟 GH-

7、IGF生長軸基因、肌肉生肌因子基因表達量的影響，結(jié)果表明：對照組雄魚較雌魚 T水平更高，E2水平更低。E2注射后升高血清E2水平，T注射后升高血清T水平，對照組雌魚較雄魚生長率較低，E2促進雌魚生長，對雄魚生長影響不明顯，T顯著促進雄魚生長，對雌魚生長影響不明顯；E2顯著促進雌魚igf1, igf2, ghr1, ghr2表達；但不顯著影響雄魚igf1, igf2,一定程度降低ghr1, ghr2表達T對雄魚作用大于雌魚；顯著升高雄魚i

8、gf1, igf2, ghr1, ghr2表達；升高雌魚ghr1, ghr2表達，顯著降低igf2表達。E2顯著升高雌魚myod1, myf5表達量，T顯著升高雄魚 myod1, myod2, myf5表達量，E2降低雄魚myog2, myf5表達量，不影響myod1表達量，T升高雌魚myog表達量，不顯著影響myod1, myod2表達量。性類固醇激素對GH-IGF生長軸、生肌因子相關(guān)基因表達有一定的作用，這種作用表現(xiàn)出明顯的雌雄差異

9、性，推測性雌雄類固醇激素水平不同可能是導(dǎo)致雌雄個體生長差異顯著的一個重要原因。
　?。?）攝食與消化水平是影響魚類生長的重要環(huán)節(jié)。通過體外注射雌二醇（E2）、睪酮（T），測定注射后6h、12h、24h尼羅羅非魚雌雄魚消化酶（胃蛋白酶、腸淀粉酶、腸脂肪酶）活性，并采用熒光定量PCR方法，比較腦組織ghrelin、leptin、orexin、NPY、CCK mRNA表達量的差異。結(jié)果表明，注射后24h，T顯著提高雄魚淀粉酶活性；注射E

10、2和T后12h，對照組三種消化酶活性均升高，且此時對照組雄魚淀粉酶、脂肪酶活性較雌魚高。注射后6h、12h、24h，E2顯著升高雌魚ghrelin、NPY mRNA表達量，但不顯著影響雄魚，E2降低雌魚leptin mRNA表達量，6h時E2升高雄魚leptin mRNA表達量，12h、24h影響不明顯；注射T顯著升高雄魚ghrelin、NPY mRNA表達量，但不顯著影響雌魚，降低雄魚leptin mRNA表達量，6h、24h時T顯著

11、升高雌魚leptin mRNA表達量，12h時影響不明顯；24h時E2顯著升高雌魚 orexin表達量，其他時間點影響不顯著，24h時T顯著升高雄魚orexin表達量，其他時間點影響不顯著；6h、12h、24h時E2顯著降低雌魚CCK mRNA表達量，T顯著降低雄魚表達量。結(jié)果表明，E2顯著升高雌魚、T顯著升高雄魚促攝食基因表達量降低抑制食欲基因表達量，對雌雄魚脂肪酶、蛋白酶影響不明顯，攝食基因可能參與了性類固醇激素對雌雄尼羅羅非魚生長

12、的調(diào)節(jié)。
　?。?）采用Western-blot、免疫組化、熒光定量PCR的方法，對尼羅羅非魚雌雄魚肝臟、性腺、腸、腎臟進行雌雄激素受體（ER、AR）基因、蛋白質(zhì)表達水平進行了比較，Western-blot表明：性腺（精巢、卵巢）ER蛋白表達量最高，腸、腎臟中差異不明顯，雌雄魚肝臟中ER蛋白表達量差異明顯，卵巢和精巢ER蛋白表達量差異明顯；卵巢和精巢AR蛋白表達量差異明顯，雌雄魚腎臟AR蛋白表達量差異明顯，性腺（精巢、卵巢）AR蛋

13、白表達量最高。免疫組化結(jié)果表明：雌雄魚性腺、腸、腎中均檢測到了ER和AR免疫陽性反應(yīng)，雌魚肝臟陽性細胞主要分布在中央靜脈附近，雌魚肝臟未發(fā)現(xiàn)AR陽性反應(yīng)，雄魚肝臟未發(fā)現(xiàn)ER陽性反應(yīng)；雄魚腸免疫陽性細胞主要分布在腸絨毛和腸粘膜下層；雌魚腎ER較雄魚陽性反應(yīng)增強，雄魚腎AR較雌魚陽性反應(yīng)增強，免疫陽性反應(yīng)主要分布在腎小管中；卵巢ER陽性細胞分布在濾泡膜周圍，且其ER陽性反應(yīng)較雄魚明顯，精巢AR陽性細胞分布在精小管周圍，且其AR陽性反應(yīng)較雌魚