半滑舌鰨雌核發(fā)育誘導(dǎo)、遺傳分析及生長(zhǎng)相關(guān)基因雌雄差異表達(dá)研究.pdf

1、半滑舌鰨是當(dāng)前國(guó)內(nèi)重要的海水養(yǎng)殖魚類，但半滑舌鰨雌雄性生長(zhǎng)速度差異巨大，雄性個(gè)體生長(zhǎng)速度過慢加大了養(yǎng)殖成本，阻礙了半滑舌鰨養(yǎng)殖業(yè)的健康、快速發(fā)展。因此，培育全雌半滑舌鰨苗種，實(shí)現(xiàn)全雌化養(yǎng)殖成為當(dāng)前半滑舌鰨養(yǎng)殖業(yè)亟待解決的問題。而揭示半滑舌鰨雌雄生長(zhǎng)差異的分子機(jī)理，具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。本文通過靜水壓和低溫處理抑制半滑舌鰨第二極體釋放，誘導(dǎo)半滑舌鰨雌核發(fā)育二倍體，用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)雌核發(fā)育個(gè)體進(jìn)行分析鑒定，并以減數(shù)雌核發(fā)育家系為材料對(duì)部分

2、微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行了定位研究；利用半滑舌鰨雌性特異標(biāo)記遺傳性別鑒定技術(shù)對(duì)半滑舌鰨養(yǎng)殖群體中生理雄魚的遺傳性別進(jìn)行了分析、鑒定；采用RT-PCR、RACE、real-time PCR等技術(shù)克隆了半滑舌鰨PACAP/PRP、GH、GHR1、GHR2、IGF-I、IGF-II基因的全長(zhǎng)cDNA序列，研究了其組織表達(dá)分布和各基因在各生長(zhǎng)階段下雌雄間表達(dá)差異等。其主要結(jié)果如下：(1)通過靜水壓和低溫處理誘導(dǎo)半滑舌鰨雌核發(fā)育二倍體。結(jié)果表明，紫外照射導(dǎo)

3、致各處理組精子的受精率逐漸降低，但劑量在15-50 mJ cm-2范圍內(nèi)，各處理組精子的受精率無顯著差異；并且當(dāng)照射劑量增加到50 mJ cm-2時(shí)，倍性分析顯示紫外處理精子受精卵的單倍體率增大到100％，因此，舌鰨精子的適宜紫外滅活劑量為50 mJ cm-2(而實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示鱸魚凍精適宜的紫外滅活劑量為30 mJ cm-2)。紫外滅活精子與舌鰨卵“受精”后5 min，5℃下處理20-23 min，誘導(dǎo)率最高為10.0±1.O％。而靜水壓

4、處理的最佳條件是“受精”后5 min，70 MPa下處理4 mm，誘導(dǎo)率最高為8.0％。微衛(wèi)星標(biāo)記分析顯示同一家系中推定的24尾雌核發(fā)育個(gè)體中沒有異于母本的基因型。性別鑒定結(jié)果顯示，24尾雌核發(fā)育二倍體中只有4尾產(chǎn)生了205 bp的雌性特異條帶，另外20尾沒有相應(yīng)的條帶，因此，該家系中雌核發(fā)育二倍體的雌性個(gè)體比例為20％。在另外一個(gè)家系中，雌性個(gè)體比例為9/30。半滑舌鰨雌核發(fā)育個(gè)體雌性比例偏低，很可能是W染色體上有純合致死基因。

5、 (2)紫外滅活的異源和同源精子誘導(dǎo)的半滑舌鰨單倍體胚胎發(fā)育過程比較結(jié)果顯示，在胚盤形成期、二細(xì)胞期、多細(xì)胞期和囊胚期，異源和同源精子誘導(dǎo)的半滑舌鰨單倍體胚胎發(fā)育時(shí)序及形態(tài)無顯著差異。之后，滅活的異源精子誘導(dǎo)的單倍體胚胎發(fā)育速度比同源精子誘導(dǎo)的單倍體胚胎要慢，至受精后18h48min已慢1個(gè)發(fā)育時(shí)期。肌節(jié)期后，同源精子和異源精子誘導(dǎo)的單倍體胚胎發(fā)育都嚴(yán)重受阻，速度無顯著差異；且單倍體胚胎陸續(xù)大量死亡，但異源精子誘導(dǎo)的單倍體胚胎死亡率明

6、顯要大于同源精子誘導(dǎo)的單倍體胚胎。異源和同源精子誘導(dǎo)的單倍體胚胎孵出的仔魚均表現(xiàn)有單倍體綜合癥，外形基本一致。 (3)M-C定位研究結(jié)果顯示，21個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記中18個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記符合孟德爾分離比，3個(gè)位點(diǎn)(Cyse03，Cyse27，Csou3)(14.3％)顯著偏離預(yù)期理論比(P<0.05)。各標(biāo)記與著絲粒間的重組率從0.1666(Cyse26)到1.000(Cyse25，Cyse31，Cyse46和Cyse10c)不等，平均重

7、組率為0.846。根據(jù)各標(biāo)記與著絲粒間的遺傳距離可推斷，13個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記中有10個(gè)在端粒區(qū)，1個(gè)在著絲粒區(qū)，2個(gè)在染色體的中部。13標(biāo)記中，M-C間重組率顯著高于0.67的有10個(gè)，這暗示了在半滑舌鰨減數(shù)分裂過程中存在明顯的交叉干涉。 (4)自然性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)。雌性特異標(biāo)記遺傳性別鑒定結(jié)果顯示，32尾雌魚均能擴(kuò)增出205bp的雌性特異條帶：39尾表型雄魚，僅一尾魚擴(kuò)增出了雌性特異條帶，因此這尾魚遺傳上為雌性，是一尾偽雄魚。對(duì)半

8、滑舌鰨養(yǎng)殖群體生理雄魚大規(guī)模檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖群體自然性逆轉(zhuǎn)偽雄魚比例為1.66％。自然性逆轉(zhuǎn)偽雄魚性腺組織學(xué)觀察顯示，偽雄魚性腺中也有大量的精母細(xì)胞，但數(shù)量比正常雄魚的略少。 (5)半滑舌鰨生長(zhǎng)相關(guān)基因克隆及雌雄生長(zhǎng)差異表達(dá)分析結(jié)果顯示，50日齡-5月齡時(shí)，半滑舌鰨雌雄個(gè)體體重差異不顯著；7月齡后，雌雄間差異顯著，雌性生長(zhǎng)速度顯著快于雄性；至12月齡時(shí)，差異達(dá)最大，雌魚平均體重是雄魚的10.4倍。采用同源克隆策略獲得了6個(gè)半滑舌鰨

9、生長(zhǎng)相關(guān)基因的全長(zhǎng)cDNA序列，它們分別是PACAP/PRP(1237bp)(Genbank No.FJ608666)、GH(817 bp)(FJ608663)、GHR1(2377 bp)(FJ608664)、GHR2(3112 bp)(FJ608665)、IGF-I(1207 bp)(FJ608667)、IGF4-II(1473 bp)(FJ608668)。在PACAP/PRP中存在外顯子漏譯現(xiàn)象。組織表達(dá)分析顯示，PACAP/PRP

10、基因在腦和眼中有表達(dá)，在其他組織中不表達(dá)。長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄子(編碼PRP)在腦和眼中的表達(dá)量都明顯大于短的轉(zhuǎn)錄子。GH基因僅在垂體中表達(dá)。生長(zhǎng)激素受體I和II型基因在半滑舌鰨血、腦等14種組織中都有表達(dá)。半滑舌鰨胰島素樣生長(zhǎng)因子I在舌鰨腦、眼、鰓、頭腎、腸、肝、肌肉、垂體、皮膚、脾中都表達(dá)，其中在肝臟中表達(dá)量最大。在舌鰨頭腎、腸、肌肉、脾中雌雄個(gè)體間表達(dá)量有一定差異。半滑舌鰨胰島素樣生長(zhǎng)因子II在14種組織中都有表達(dá)，在舌鰨血、腸、肌肉、性腺、皮

11、膚等組織中，雌雄個(gè)體間表達(dá)量有一定差異。Real-time PCR分析顯示，PRP/PACAP mRNA表達(dá)水平在各生長(zhǎng)階段雌雄間差異不顯著(P>0.05)；而生長(zhǎng)激素基因在半滑舌鰨雌性垂體中的表達(dá)量顯著高于雄性；生長(zhǎng)激素受體I型基因在50日齡-12月齡的舌鰨雄性個(gè)體中的表達(dá)量都高于雌性，8月齡后雌雄間表達(dá)量的差異越來越小，至12月齡時(shí)已無顯著差異。生長(zhǎng)激素受體II型基因在舌鰨發(fā)育的初期，在雄性肝臟中的表達(dá)量顯著大于雌性，但在80日齡時(shí)

12、，雌雄間表達(dá)量無顯著差異。7月齡后，生長(zhǎng)激素受體II型基因在雌性肝臟中的表達(dá)量又大于雄性，但差異不顯著。IGF-I在80日-7月齡的雌雄舌鰨肝臟中表達(dá)量無差異，8月和9月齡的雌性個(gè)體中IGF-I mRNA表達(dá)量高于雄性個(gè)體，但12月齡的雌雄舌鰨間IGF-I mRNA表達(dá)量無顯著差異。8月齡前，雌雄舌鰨間IGF-II mRNA表達(dá)量無顯著差異，但9月和12月齡的雌性舌鰨IGF-II mRNA表達(dá)量顯著高于雄性?？傊?，生長(zhǎng)軸調(diào)控的上游基因(

13、PACAP)雌雄間表達(dá)量無差異，生長(zhǎng)軸調(diào)控的主基因(GH)雌性中表達(dá)量顯著高于雄性，GHR1基因在雄性中的表達(dá)量高于雌性，這可能是一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制或功能代償機(jī)制，而IGF基因在生長(zhǎng)發(fā)育后期的雌性中表達(dá)量略高于雄性。 本文篩選到了半滑舌鰨雌核發(fā)育誘導(dǎo)的適宜條件，獲得了500余尾1齡的半滑舌鰨減數(shù)雌核個(gè)體，并以半滑舌鰨雌核發(fā)育家系為材料定位了13個(gè)標(biāo)記與著絲粒的遺傳距離；發(fā)現(xiàn)了半滑舌鰨養(yǎng)殖群體中存在自然性逆轉(zhuǎn)的偽雄魚；初步揭示了半