紅花查爾酮合成酶基因的表達(dá)及紅花黃色素類成分積累的分析.pdf

1、紅花為菊科植物紅花Carthamus tinctorius L.的干燥花，是活血化瘀要藥，可活血通經(jīng)、散瘀止痛，用于經(jīng)閉，痛經(jīng)，惡露不行，癥瘕痞塊等，大量應(yīng)用于中成藥生產(chǎn)和臨床處方中，如《國家基本藥品》目錄中的血府逐瘀丸、乳癖消片、傷科接骨片、舒筋活血丸、頸舒顆粒等中成藥都用到了紅花。紅花有效成分為紅花黃色素類查爾酮成分。
　　本研究從紅花黃酮類成分生物合成路徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶基因——查爾酮合成酶基因（chalcone syntha

2、se gene，chs）和紅花黃色素類成分（saffloryellow，SY）入手，克隆、分析、表達(dá)了查爾酮合成酶基因，分析了紅花黃色素類成分的積累規(guī)律，為紅花黃色素類成分生物合成機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下：
　　1.紅花chs的克隆、生物信息學(xué)分析及表達(dá)
　　分別從紅花花期（1d-7d）新鮮花冠中提取RNA，將質(zhì)量和純度合格的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計(jì)特異性引物，考察PCR條件，得到PCR產(chǎn)物，測序PCR產(chǎn)物序列

3、，結(jié)果為：紅花RNA提取的最佳方法是改良的Trizol法；PCR反應(yīng)最佳特異性引物是： Forward-Primer： ATGGCATCCTTAACCGATATT，Reverse-Primer：TTAAGCGGCAATGGGGGT；最佳反應(yīng)條件是：94℃，3 min，30 cycles（94℃，30 sec；64.2℃，30 sec；72℃，10 min），72℃，5 min；PCR產(chǎn)物序列全長為1149 bp，具有1041 bp的完整

4、開放閱讀框，編碼346個(gè)氨基酸；NCBI上的Blastp比對發(fā)現(xiàn)，該蛋白屬于CHS家族，比對結(jié)果顯示紅花CHS與100余種 NCBI上登錄的植物有相似性，其中與菊科管狀花亞科植物水飛薊（Silybum marianum）、翠菊（Callistephus chinensis）、菊花（Dendranthema morifolium）、紅鳳菜（Gynura bicolor）、黑心金光菊（Rudbeckia hirta）、大麗花（Dahlia

5、pinnata）的相似性分別達(dá)95％、95%、94%、94%、93%、92%。
　　對紅花 chs進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果為：MEGA5.1構(gòu)建進(jìn)化樹顯示紅花CHS與水飛薊CHS親緣關(guān)系最近，兩者同屬經(jīng)典植物分類學(xué)中的菊科管狀花亞科菜薊族；ProtParam預(yù)測紅花CHS蛋白分子式為C1678H2693N451O493S20，分子量為37.7 kD，等電點(diǎn)為6.10，負(fù)電荷的氨基酸殘基數(shù)（Asp+Glu）為42，正電荷的氨基酸殘基

6、數(shù)（Arg+Lys）為38，不穩(wěn)定參數(shù)為39.39，屬于穩(wěn)定蛋白；Protscale預(yù)測編碼氨基酸序列的疏水性圖譜，整個(gè)肽鏈中最高疏水峰值2.218，最高親水峰值為-2.164，親水性氨基酸相對較為均勻的分布在整個(gè)肽鏈中，略多于疏水性氨基酸；Protscale預(yù)測紅花CHS的二級結(jié)構(gòu)顯示約有142個(gè)α-螺旋，占45%，48個(gè)伸展片段，占14%，156個(gè)自由卷曲，占41%；Protscale對紅花CHS的氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的同源

7、性建模，獲得了紅花CHS氨基酸序列的預(yù)測三級結(jié)構(gòu)。
　　通過對標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增曲線、溶解曲線的考察，建立了紅花chs和管家基因25s的real-time PCR表達(dá)方法，得到了紅花chs的相對表達(dá)量，從大到小依次為：3d（2.80）>6d（1.12）>2d（1.10）>7d（0.85）>5d（0.82）>1d（0.28）>4d（0.13）。紅花chs的相對表達(dá)量呈現(xiàn)出四個(gè)階段：1d-3d為快速上升期，3d相對表達(dá)量最高，高達(dá)2.8；

8、3d-4d為拐點(diǎn)期，4d相對表達(dá)量最低，僅有0.13；4d-6d為緩慢上升期；6d-7d為衰減期。
　　2、紅花羥基紅花黃色素A的積累規(guī)律研究
　　HSYA為SY中含量最高的物質(zhì)，也是紅花主要的有效成分，研究HSYA積累規(guī)律，有助于分析SY積累規(guī)律。因此采用HPLC測定花期每天HSYA含量，測定結(jié)果為：3d（1.71%）>2d（1.53%）>4d（1.42%）>5d（1.14%）>6d（0.68%）>7d（0.66%）>1d

9、（0.46%）。2d-5d均符合《中國藥典》2010年版一部要求。從結(jié)果可以看出，HSYA積累呈現(xiàn)出先增后減的動態(tài)變化規(guī)律，其中3d最高，達(dá)1.71%，1d含量最低，僅為0.46%，樣本2d-4d HSYA含量較高，但紅花藥用部位為開放的管狀花，花期第二天開放的管狀花數(shù)量較少，不宜采收，因此在花開第三天、第四天采收最佳。
　　3、紅花HPLC指紋圖譜研究
　　為更全面掌握SY積累規(guī)律，通過對檢測波長、流動相考察，建立了紅花H

10、PLC指紋圖譜色譜條件：色譜柱：ZORBAX SB-C18柱（4.6×250 mm，5μm）；流動相：A為乙腈，B為0.01％三氟乙酸溶液，梯度洗脫：0～10 min，2％～10％A；10~25 min，10％～15％A；25~45 min，l5％～20%A；45～65 min，20%～25％A；65~70 min，25%～2％A；檢測波長：403 nm；柱溫：25℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：20μL；采集花期1d-7d樣本的指

11、紋圖譜；并建立了紅花指紋圖譜共有模式圖。結(jié)果顯示1d-7d樣本有12個(gè)共有峰，相似度較高，在0.97以上，其中7號峰和10號峰峰面積較高，占總峰面積的80%左右。
　　采用LC-MS技術(shù)分析峰面積較大的7號峰及10號峰。7號峰在負(fù)離子模式下，其質(zhì)荷比為611，碎片離子分別為491，403，325，207，鑒定其為羥基紅花黃色素A（hydroxysaffloryellow A，HSYA，C27H32O16，分子量612）。10號峰在

12、負(fù)離子模式下，其質(zhì)荷比為1043，碎片離子分別為1025，923，593，449，287，鑒定其為脫水紅花黃色素 B（anhydrosaffloryellow B，AHSYB，C48H52O26，分子量1044）。
　　紅花指紋圖譜總峰面積從大到小依次為：3d>2d>4d>5d>6d>1d>7d，呈現(xiàn)出1d-3d遞增、3d-7d遞減的趨勢；HSYA和AHSYB峰面積從大到小依次為：3d>2d>4d>5d>6d>7d>1d，也呈現(xiàn)出

13、1d-3d遞增3d-7d遞減的規(guī)律。
　　4、紅花chs相對表達(dá)量與紅花黃色素類成分積累量的關(guān)聯(lián)性分析
　　分析紅花chs相對表達(dá)量與SY積累量關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)：1d-3d為chs相對表達(dá)量的快速上升期，其快速上升至最高，SY積累量隨之上升至最高；3d-4d為chs相對表達(dá)量的拐點(diǎn)期，其急劇下降到最低，SY積累量也隨之降低，但幅度較??；4d-6d為chs相對表達(dá)量的緩慢上升期，SY積累量在該時(shí)期緩慢下降；6d-7d為 chs衰