基因組不穩(wěn)定性和印記基因甲基化狀態(tài)與神經(jīng)管畸形關(guān)系的初步研究.pdf

1、出生缺陷(birthdefects)是指胚胎或胎兒在發(fā)育過(guò)程中所發(fā)生的結(jié)構(gòu)或功能的異常，它是嬰兒死亡、兒童和成人殘疾的主要原因之一。神經(jīng)管畸形(NTDs)是一類常見的出生缺陷，包括無(wú)腦和脊柱裂等，在世界范圍內(nèi)的平均發(fā)生率為1/1000。無(wú)腦胎兒通常死產(chǎn)，或產(chǎn)后不久即死亡，脊柱裂胎兒能幸存下來(lái)，但他們可能帶有終生缺陷，生活質(zhì)量也會(huì)因此受到極大的影響。有關(guān)NTDs的研究已經(jīng)進(jìn)行多年，主要包括兩個(gè)方面：一、尋找NTDs的相關(guān)基因；二、研究環(huán)境

2、因素在NTDs發(fā)生中的作用。研究人員一直致力于尋找NTDs候選基因，通過(guò)生物化學(xué)和發(fā)育途徑研究，NTDs動(dòng)物模型的建立以及定位候選基因等，獲得了100個(gè)以上的候選基因。然而，在人群中的病例-對(duì)照研究和基于家系的關(guān)聯(lián)研究表明，單個(gè)基因的功能缺陷并不足于解釋全部NTDs的發(fā)生機(jī)理。影響NTDs的環(huán)境因素較多，主要包括孕婦營(yíng)養(yǎng)因素，感染以及一些理化因素等，孕婦營(yíng)養(yǎng)因素在其中起重要作用。維生素B12，葉酸的缺乏是NTDs的風(fēng)險(xiǎn)因子，孕婦適量補(bǔ)充

3、葉酸能夠降低NTDs的發(fā)生率達(dá)50％-75%。葉酸是機(jī)體內(nèi)甲基供體，參與DNA合成，DNA甲基化等多個(gè)重要生理進(jìn)程。葉酸缺乏增高小鼠DNA中尿嘧啶的錯(cuò)誤摻入，這可能導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定；同時(shí)，葉酸缺乏也是引起全基因組低甲基化的原因之一。因此，基因組不穩(wěn)定和DNA甲基化水平紊亂可能是NTDs的發(fā)生機(jī)制之一。然而，有關(guān)NTDs與基因組穩(wěn)定性和DNA甲基化關(guān)系的報(bào)道目前仍然甚少。
　　 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)是基因組不穩(wěn)定的表現(xiàn)之一，它

4、是DNA復(fù)制過(guò)程中由于鏈滑動(dòng)導(dǎo)致的重復(fù)單位增加或缺失未被DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)(MMR)修復(fù)所致。因此，MSI一方面提示MMR可能存在功能缺陷，另一方面，微衛(wèi)星序列也是一個(gè)基因表達(dá)調(diào)節(jié)子，微衛(wèi)星序列長(zhǎng)度的變化可能影響其相關(guān)基因的表達(dá)，例如轉(zhuǎn)錄率、RNA穩(wěn)定性、剪接效率以及RNA-蛋白質(zhì)的相互作用。
　　 表觀遺傳學(xué)是研究沒有DNA序列改變，經(jīng)減數(shù)分裂和／或有絲分裂后可遺傳的基因表達(dá)改變。DNA甲基化是其中的重要組成部分，它是一種基因

5、轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。在一些基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化是導(dǎo)致該基因表達(dá)下降的原因之一；而印記基因的表達(dá)受相關(guān)DMRs(differentiallymethylatedregions)的影響，它們甲基化狀態(tài)的改變與一些先天性生長(zhǎng)障礙疾病相關(guān)。
　　 雖然NTDs的相關(guān)研究取得了一定進(jìn)展，但其發(fā)生機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。因此，從基因組不穩(wěn)定性和表觀遺傳學(xué)改變方面進(jìn)行研究有利于進(jìn)一步探索NTDs的發(fā)生機(jī)制。
　　 研究目的：
　　

6、1．通過(guò)MSI實(shí)驗(yàn)觀察NTDs中是否存在基因組不穩(wěn)定現(xiàn)象。
　　 2．觀察NTDs中hMLH1，hMSH2啟動(dòng)子區(qū)甲基化模式是否存在變化。
　　 3．觀察NTDs中印記基因H19DMR1和IGF2DMR0甲基化狀態(tài)是否發(fā)生改變。
　　 4．探索遺傳穩(wěn)定性及印記基因甲基化異常與NTDs發(fā)生的可能聯(lián)系。
　　 研究方法：
　　 1．使用PCR-尿素變性聚丙烯酰胺電泳和Genescan分析NTDs中MS

7、I，選擇6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)Bat25,Bat26，Bat34C4，D2S123，D2S119，D3S1611為檢測(cè)目標(biāo)。
　　 2．使用甲基特異性PCR(MSP)分析NTDs中hMLH1，hMSH2啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)。
　　 3．使用亞硫酸酸鹽克隆測(cè)序分析H19DMR1和IGF2DMR0甲基化狀態(tài)和hMLH1，hMSH2啟動(dòng)子區(qū)甲基化模式。
　　 結(jié)果：
　　 1．使用PCR-尿素變性聚丙烯酰胺電泳和Gene

8、scan分析50例NTDs中MSI現(xiàn)象，MSI陽(yáng)性例數(shù)為23例，總MSI陽(yáng)性率為46%。
　　 2．MSP結(jié)果顯示hMLH1，hMSH2啟動(dòng)子區(qū)未發(fā)生甲基化；亞硫酸鹽克隆測(cè)序顯示：hMSH2啟動(dòng)子區(qū)為非甲基化狀態(tài)，hMLH1啟動(dòng)子區(qū)出現(xiàn)特異性的第4,5CG位點(diǎn)部分甲基化，但與對(duì)照組相比未見明顯差異。
　　 3．NTDs中66.7%的樣品出現(xiàn)H19DMR1高甲基化，對(duì)照組H19DMR1高甲基化比例為28.6%，NTDs中高