非小細胞肺癌線粒體基因組不穩(wěn)定性的研究.pdf

1、線粒體是真核細胞細胞核外唯一含有自己的基因組的細胞器。作為細胞的“動力工廠”，它在細胞的能量代謝、氧自由基生成和凋亡調控過程中扮演重要角色。哺乳動物mtDNA(MitochondrialDNA，mtDNA)是一全長為16.5kb左右的雙鏈閉環(huán)分子，在長度僅為16.5kb左右的基因組內，定位了2種rRNA、22種參與線粒體蛋白合成的tRNA和13種涉及呼吸作用和氧化磷酸化功能的多肽鏈基因。線粒體DNA為多拷貝基因，每個細胞器都含有數個到上

2、千個不等的線粒體，而每個線粒體可含有數個到數十個不等的線粒體DNA分子。與核基因組相比，其相對分子量小，缺乏組蛋白保護，缺乏損失修復系統(tǒng)等特點決定了它是致癌物作用的重要靶點。線粒體DNA突變發(fā)生率被認為是核DNA的10-20倍。近年來，隨著對線粒體在細胞凋亡調控中的中心地位和誘發(fā)細胞癌變等腫瘤生物學過程中所起作用的進一步了解，線粒體DNA突變成為目前腫瘤研究的熱點之一。線粒體DNA突變目前已在各種腫瘤及腫瘤細胞株中發(fā)現。報道的mtDNA

3、遺傳改變包括，發(fā)生于編碼區(qū)及非編碼區(qū)(即控制區(qū))內的各種點突變、片段缺失、重復或插入突變及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatelliteinstability，MSI)等。肺癌組織中mtDNA的大片段缺失狀況、控制區(qū)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和mtDNA的拷貝數有何改變?至今尚不清禁。mtDNA控制區(qū)微衛(wèi)星不穩(wěn)定及線粒體轉錄因子A(mitochondrialtranscriptionfact6rA，mtTFA)的表達對線粒體DNA拷貝數改變又有何影

4、響?也未見文獻報道。 目的： 一、明確mtDNA4977bp大片段缺失在肺癌組織、癌旁正常組織及非癌病人肺組織中的分布頻率，了解肺癌組織mtMSI發(fā)生的具體方式、位置以及它與年齡、吸煙及組織學病理類型等臨床指標間的關系，探討mtDNA大片段缺失、控制區(qū)微衛(wèi)星不穩(wěn)定與腫瘤的相關性。 二、建立一種精確定量組織細胞線粒體DNA拷貝數的方法，了解肺癌組織中mtDNA的拷貝數的改變及其與肺癌的相關性，明確肺癌組織中線粒體轉

5、錄因子A的表達水平，探討mtDNA控制區(qū)微衛(wèi)星不穩(wěn)定、線粒體轉錄因子A的表達與mtDNA拷貝數改變之間的關系。 方法： 本研究采用長距離PCR方法對37對肺癌組織及相應的癌旁正常肺組織、20例非癌病人正常肺組織樣本mtDNA4977bp缺失突變進行了檢測；采用PCR-SSCP和序列測定技術對37例肺癌組織線粒體DNA控制區(qū)的三個微衛(wèi)星位點進行了分析；以核DNA作為定量mtDNA拷貝數的內對照和以β-globin基因作為二

6、倍體核基因組含量的標記，通過兩個單獨的實時熒光定量PCR，對組織細胞中線粒體DNA拷貝數進行了精確定量(拷貝數/細胞)；采用RT-PCR方法檢測了肺癌中線粒體轉錄因子A的表達變化，并分析了mtDNA控制區(qū)微衛(wèi)星不穩(wěn)定、線粒體轉錄因子A的表達與mtDNA拷貝數改變之間的關系。 結果： 一、肺癌組織、癌旁正常肺組織及非癌病人正常肺組織中均檢測出線粒體DNA4977bp片段缺失。37例肺癌組織標本中20例(54.1％)檢測到4

7、977bp缺失，37例相應的癌旁肺組織22例(59.5％)有缺失，其中14例是肺癌組織和癌旁正常組織均有缺失，8例在肺癌組織中未發(fā)現而卻在癌旁正常組織檢測到缺失。20例非癌病人正常肺組織中也有6例(30％)出現4977bp片段缺失。mtDNA4977bp缺失率有隨年齡增大而增高的趨勢，以年齡55歲，將組織樣本分為高年齡組和低年齡組。高年齡組4977bp缺失率顯著高于低年齡組(P＜0.01)。吸煙和不吸煙者之間缺失發(fā)生率有顯著差異(P＜0

8、.01)，曾經吸煙和不吸煙者之間缺失發(fā)生率有顯著差異(P＜0.01)，而吸煙和曾經吸煙之間缺失發(fā)生率無明顯差異(P＞0.05)。 二、37例肺癌樣本中共檢出mtMSI12例(32.4％)，mtMSI發(fā)生率為32.4％(12/37)。其中1個位點mtMSI陽性者11例(29.7％)，有2個位點(D310和D16184)mtMSI陽性者1例(2.7％)。12例mtMSI中，2例為同質性，其余10例為異質性突變。微衛(wèi)星位點序列測定結果

9、發(fā)現，12例mtMSI中，9例為堿基的缺失或插入，3例為nt16，189bp處的T核苷酸發(fā)生的T→C的點突變。 三、建立了一種精確定量組織細胞線粒體DNA拷貝數的方法。肺癌組織線粒體DNA的平均拷貝數/細胞為395±125，而相對應的正常肺組織為733±196，前者顯著低于后者(p＜0.001)。含有mtMSI的12例肺癌組織其線粒體DNA的平均拷貝數顯著低于其余的肺癌組織(p＜0.05)。 四、癌組織和癌旁正常組織mt

10、TFAmRNA的平均表達量之間并無顯著差異。線性回歸分析結果表明，癌旁正常組織中，mtTFAmRNA的表達量和線粒體DNA拷貝數之間有直接的相關性(r=0.910，p＜0.01)；而在癌組織中，線粒體DNA拷貝數和mtTFAmRNA的表達水平無關(r=0.135，p＞0.05)。 結論： 一、肺癌組織、癌旁正常肺組織及非癌病人正常肺組織中均存在者線粒體DNA大片段缺失。部分病例中肺癌組織中未發(fā)現而卻在癌旁正常組織檢測到缺

11、失。肺癌和癌旁組織線粒體DNA4977bp大片段缺失的發(fā)生率高于正常肺組織，但在正常肺組織，特別是吸煙者和老年人群中亦存在著較高的缺失發(fā)生率。說明線粒體DNA4977bp大片段缺失并非肺癌特異性突變，而與年齡、吸煙等因素密切相關，其可能反映了mtDNA損傷積累過程中環(huán)境和年齡因素的作用。 二、堿基的插入或缺失是mtDNAD303、D514微衛(wèi)星位點發(fā)生長度不穩(wěn)定的常見原因。而nt16，189bp處的T核苷酸發(fā)生的T→C的點突變是

12、D16184微衛(wèi)星位點長度不穩(wěn)定性發(fā)生的重要原因。肺癌mtMSI發(fā)生率與患者性別、年齡及腫瘤的病理類型無相關性，而與是否吸煙有關。mtDNA非編碼區(qū)的遺傳不穩(wěn)定性可能與腫瘤細胞中mtDNA的復制、轉錄水平的變化和拷貝數的改變有關,mtMSI在部分肺癌的發(fā)生發(fā)展中可能起一定作用。 三、肺癌組織線粒體基因組的拷貝數明顯降低。肺癌線粒體基因組拷貝數的改變和控制區(qū)內的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性具有相關性。線粒體DNA控制區(qū)關鍵位點或相鄰區(qū)域內的遺傳

13、不穩(wěn)定性可能會影響mtDNA的復制，從而導致線粒體DNA拷貝數的降低。 四、肺癌中線粒體DNA拷貝數雖然下降，但mtDNA轉錄、復制的主要調節(jié)因子mtTFA的表達并沒有下調；說明在肺癌組織中控制mtDNA轉錄、復制的主要調節(jié)因子對線粒體DNA拷貝數的調控功能缺失。 五、線粒體DNA自身遺傳結構的改變和mtDNA轉錄、復制的核調節(jié)因子調控功能的喪失等多種因素共同作用可能是導致腫瘤線粒體DNA拷貝數降低的原因；線粒體DNA遺