Rho-ROCK信號通路介導新生大鼠神經(jīng)元缺氧損傷的作用機制研究.pdf

1、目的：
　　新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxia ischemic encephalopathy，HIE)，是由于圍生期窒息缺氧所致新生兒缺氧缺血性腦損傷（hypoxia ischemic brain damage，HIBD）。近年研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元細胞骨架降解是導致缺氧缺血腦損傷的重要因素，細胞骨架受到Rho及其下游效應(yīng)物Rho激酶（Rho-associated coiled-coil kinase，ROCK）系統(tǒng)調(diào)控。Rho/RO

2、CK激活可使細胞骨架肌動蛋白（F-actin）重組、生長錐塌陷、促進細胞凋亡、抑制神經(jīng)再生，如抑制其活性，可穩(wěn)定細胞骨架、促進軸突生長、保護神經(jīng)元。本研究擬以體外培養(yǎng)的新生大鼠神經(jīng)元為研究對象，觀察缺氧損傷后神經(jīng)細胞RhoA、ROCK-I、ROCK-II蛋白表達情況以及神經(jīng)元突起長度、神經(jīng)元細胞骨架F-actin等指標，并且觀察加用ROCK抑制劑法舒地爾（Fasudil）干預后上述指標的變化情況，以證實Rho/ROCK信號通路參與神經(jīng)元

3、缺氧損傷過程的假設(shè)，為臨床上開發(fā)ROCK抑制劑治療HIE提供重要的實驗依據(jù)。
　　方法：
　　取新生1d SD大鼠，離體培養(yǎng)7d皮質(zhì)神經(jīng)元分為對照組（正常培養(yǎng)細胞）、缺氧組（缺氧后加入法舒地爾的溶劑DMSO）、法舒地爾組（缺氧后加入35μM法舒地爾），缺氧組及法舒地爾組在缺氧培養(yǎng)后給予相應(yīng)藥物干預，置于37℃5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)12h，以抗βIII微管蛋白（Anti-βIII Tubulin）免疫熒光染色法測量各組神經(jīng)

4、元突起長度，以Western blot方法測定神經(jīng)元RhoA、ROCK-I、ROCK-II蛋白表達量，以Anti-F-actin免疫熒光染色激光掃描共聚焦顯微鏡拍照觀察細胞骨架F-actin的形態(tài)變化。實驗結(jié)果采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用（-x+s）表示，采用單因素方差分析比較組間差異，P<0.05表示差別有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.神經(jīng)元培養(yǎng)及鑒定
　　神經(jīng)元接種于培養(yǎng)板后，可見大而圓的神

5、經(jīng)細胞，4h后神經(jīng)細胞大部分貼壁于用多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)板中，2、3天后神經(jīng)元胞體增大，胞質(zhì)豐富，突起延長，培養(yǎng)7-9天，神經(jīng)元突起進一步延長，形成密集的神經(jīng)元細胞網(wǎng)絡(luò)。使用神經(jīng)元特異性Anti-βIII Tubulin進行神經(jīng)元鑒定。
　　2.法舒地爾對缺氧神經(jīng)元軸突的作用
　　培養(yǎng)7天的神經(jīng)元缺氧后加入法舒地爾，復氧后用Anti-βIII Tubulin進行免疫熒光染色，熒光顯微鏡拍照后對各組神經(jīng)元突起進行測量。對照組、

6、缺氧組、法舒地爾組神經(jīng)元軸突的長度（μm）分別為：68.631±10.053、18.080±4.025、43.400±4.819，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。缺氧組的神經(jīng)元突起長度短于對照組（P>0.05），法舒地爾組的神經(jīng)元突起長度長于缺氧組（P<0.05），但短于對照組（P<0.05）。提示，法舒地爾具有減輕缺氧引起的神經(jīng)元軸突縮短的作用，但不能完全逆轉(zhuǎn)缺氧損傷。
　　3.法舒地爾對Rho/ROCK蛋白表達的作用

7、　　以Western blot方法測定神經(jīng)元缺氧后Rho/ROCK蛋白的表達，對照組、缺氧組、法舒地爾組對應(yīng)的RhoA蛋白與內(nèi)參蛋白灰度的比值分別為：0.253±0.010、0.727±0.036、0.358±0.018（P<0.05）；對照組、缺氧組、法舒地爾組對應(yīng)的ROCK-I蛋白與內(nèi)參蛋白灰度的比值分別為：0.461±0.095、0.493±0.129、0.483±0.086（P>0.05）；對照組、缺氧組、法舒地爾組對應(yīng)的ROC

8、K-II蛋白與內(nèi)參蛋白灰度的比值分別為：0.646±0.032、
　　0.828±0.044、0.499±0.040（P<0.05）?？梢?，缺氧可引起RhoA和ROCK-II蛋白表達量的升高（P<0.05），但對ROCK-I蛋白的表達量卻無明顯作用（P>0.05）；法舒地爾作用后，與缺氧組對比RhoA和ROCK-II蛋白表達量降低（P<0.05），但是對于ROCK-I蛋白量的表達卻無明顯作用（P>0.05）。
　　4.法舒地

9、爾對細胞骨架的作用
　　用Anti-F-actin免疫熒光染色，隨后激光掃描共聚焦顯微鏡拍照觀察細胞骨架F-actin的形態(tài)，正常神經(jīng)元F-actin主要分布于細胞外周、軸突、樹突，形成周邊肌動蛋白絲帶且細胞骨架結(jié)構(gòu)完整，缺氧后肌動蛋白絲帶消失，F(xiàn)-actin降解，細胞骨架結(jié)構(gòu)破壞，胞質(zhì)內(nèi)應(yīng)力纖維增多，軸突回縮，神經(jīng)元特征喪失。缺氧后加入法舒地爾干預12h，可見細胞骨架F-actin較缺氧組有明顯增多，可對抗缺氧對細胞骨架的分解作