虎杖愈傷組織培養(yǎng)及次生代謝產物含量的研究.pdf

1、虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb. et Z.)為蓼科(Polygonaceae)蓼屬(Polygonum)多年生灌狀草本,主要分布于我國中部及南部地區(qū)。虎杖以其干燥根和根莖入藥,其性微寒,味微苦,具有清熱利濕、散瘀定痛、通便解毒、止咳化痰等功效是一味傳統(tǒng)中草藥。臨床上用于治療肝膽疾病,肺熱咳嗽,瘡癰腫毒以及燙傷燒傷,急性細菌性痢疾以及各類炎癥。其主要成分大黃素(emodin)具有抗炎、抗衰老、抗腫瘤、降血壓和抑

2、制心肌運動的缺血等多種藥理作用,因而大黃素含量的高低是判斷虎杖藥材質量優(yōu)劣的標志性成分。
　　由于虎杖有著較大的藥用價值,故此引起了廣泛的關注。但虎杖的活性成分含量較低,而對有效成分的大量需求導致對虎杖藥材資源的過度開發(fā);再加上傳統(tǒng)中藥使用的是虎杖的根和莖,因而為了獲取藥用部位,往往要以犧牲植物整株為代價,這就造成了對虎杖藥材資源的極大浪費。長此以往勢必會破壞植物資源的儲備,對生態(tài)環(huán)境和該物種的生存都帶來了很大的威脅。因此急需發(fā)展

3、一些新的方法和途徑對虎杖藥用資源進行更有效、更合理的開發(fā)與利用。
　　本課題運用植物組織培養(yǎng)技術(plants callus culture),利用薄層層析法(thin-layer chromatography,TLC)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)和設計正交實驗等方法,考察了不同外植體,碳源、氮源的種類和配比,有機添加物的種類及激素的濃度和配比等因素對虎

4、杖愈傷組織生長及其大黃素含量的影響,建立了虎杖愈傷組織的生長曲線(growth curve)并考察了繼代次數對虎杖愈傷組織生長及其大黃素合成的影響。通過對虎杖愈傷組織生長和次生代謝產物大黃素合成積累的規(guī)律進行的相關研究,其實驗結果如下:
　　1.以MS+6-BA0.2 mg·L-1+KT0.2 mg·L-1+2,4-D0.5 mg·L-1為培養(yǎng)基,分別以虎杖幼嫩的葉片、莖段、葉柄為外植體,通過運用薄層層析法和高效液相色譜法對愈傷組

5、織中所含大黃素進行定性和定量的檢測發(fā)現:三種外植體均可成功誘導出愈傷組織,且莖段是誘導愈傷組織的良好外植體,不僅誘導率高、誘導時間短并且大黃素的含量也較高。
　　2.虎杖愈傷組織的生長曲線基本呈S形。在24 d左右,大黃素的含量達到最高峰,此時生物量也處于較高水平,可對愈傷組織進行收獲或繼代。
　　3.3 g·L-1的葡萄糖為較理想的碳源,可有效促進虎杖愈傷組織的生長和大黃素含量的積累;當總氮濃度為60 mmol·L-1,且

6、NH4+:NO3-=1:2時,可提高愈傷組織的生物量和大黃素的含量;添加了牛肉膏的培養(yǎng)基可顯著促進愈傷組織的生長和大黃素的積累;光照12 h/d有利于愈傷組織生長量和大黃素含量的增加。當6-BA為2.5 mg·L-1,KT為0.2 mg·L-1,2,4-D為0.5 mg·L-1時,可明顯提高愈傷組織中大黃素的含量。
　　4.通過對虎杖第3代至第12代愈傷組織的生長量及大黃素含量的連續(xù)測定,其結果表明:從第5代起虎杖愈傷組織的生長量

7、和大黃素的含量基本保持穩(wěn)定,可對其進行擴大培養(yǎng)。
　　結論:外植體、碳源和氮源的種類與配比、有機添加物和生長激素的配比對虎杖愈傷組織生長及其大黃素含量的影響均有一定的影響。在實驗條件下,以莖段為外植體,3 g·L-1的葡萄糖為碳源,加入0.5 mg·L-12,4-D、2.5 mg·L-16-BA、0.2 mg·L-1KT和200 mg·L-1牛肉膏,在光照12 h/d的條件下,培養(yǎng)25 d對愈傷組織進行收獲,可獲得較大的愈傷組織生