南方紅豆杉愈傷組織培養(yǎng)及其紫杉醇含量調控的優(yōu)化研究.pdf

1、南方紅豆杉(Taxus chinensis vat.mairei)，為紅豆杉科(Taxaceae)紅豆杉屬(Taxus)在中國的1個變種，其枝、皮、葉、根和果肉中均含有抗癌藥物紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxol)。為了利用南方紅豆杉愈傷組織培養(yǎng)生產紫杉醇，本研究采用HPLC、正交實驗、愈傷組織直徑測量、稱重等方法，對南方紅豆杉嫩莖、較成熟幼莖皮、形成層組織、嫩葉、頂端分生組織5種外植體的愈傷組織誘導培養(yǎng)、培養(yǎng)基優(yōu)化、愈傷組織

2、生長和紫杉醇生物合成量調控的優(yōu)化等進行了較為系統(tǒng)的研究。結果顯示： 愈傷組織誘導，培養(yǎng)基以MS+1.2mg/L2,4-D+4mg/LNAA+2.8mg/L6-BA為佳，外植體以嫩莖和頂端分生組織最佳，其次為幼葉。愈傷組織生長增殖的優(yōu)化培養(yǎng)基為B5+0.4 mg/L 2,4-D+3.2 mg/L NAA+0.1 mg/L KT和B5+0.4 mg/L 2,4-D+3.2 mg/LNAA+0.8 mg/L。KT。有利于愈傷組織生產紫

3、杉醇的培養(yǎng)基為：B<,5>+0.8 mg/L2，4-D+2.Omg/L NAA+0.2 mg/L KT+0.1 mg/L CH。即有利于愈傷組織生長又有利于生產紫杉醇的培養(yǎng)基為B<,5>+1.2 mg/L 2,4-D+3.2 mg/LNAA+0.1 mg/L KT+0.1 mg/L CH(生長率為3.24倍/周期，1個周期約為45 d～50 d，紫杉醇含量為0.0187％)。在5種外植體中，嫩莖和葉愈傷組織合成紫杉醇的能力較其它愈傷組織

4、強。 采用杜仲綠原酸調控，以加快愈傷組織生長為目的時應選擇生長初期愈傷組織。以增加愈傷組織中紫杉醇產量為目的時則選擇生長旺盛期或生長停滯期愈傷組織，前者在培養(yǎng)基中加入1 mg/L左右95％的杜仲綠原酸可使愈傷組織中紫杉醇的含量達到0.0658％，是該組最低樣的100倍；后者紫杉醇的含量呈隨綠原酸濃度的增加而不斷增加的趨勢，當綠原酸加到10 mg/L時，愈傷組織中紫杉醇的含量達0.025％，是對照0.0058％的4.3倍。0.1

5、mg/L綠原酸+0.1mg/L水楊酸+1.7mg/L硝酸銀可誘導愈傷組織中紫杉醇含量達0.0735％，比對照(未能檢出紫杉醇的含量)提高近100倍。 采收后的愈傷組織用南方紅豆杉菌根真菌F進行發(fā)酵轉化后，愈傷組織中紫杉醇的含量較對照提高15倍之多。這一過程對加入的菌液量、發(fā)酵轉化時間均較敏感。 過多、過長都會導致愈傷組織中紫杉醇含量的降低，以每20 g愈傷組織中加入10 mL菌液、發(fā)酵轉化0.5 d為佳。由南方紅豆杉外植

6、體來源的差異和培養(yǎng)基中植物生長調節(jié)劑的差異所引起的愈傷組織生長量間的差異會因反復繼代培養(yǎng)被消除。有利南方紅豆杉愈傷組織生長的植物生長調節(jié)劑配方沒有唯一性。但不同調節(jié)劑濃度和組合作用下的同源愈傷組織中、相同調節(jié)劑作用下不同源愈傷組織中紫杉醇含量均存在著極顯著差異，適當水平(2mg/L)的2,4-D單用，或與適當水平的KT、6-BA、KT+GA配合使用，對南方紅豆杉愈傷組織紫杉醇的合成較有利，NAA則不太有利。 南方紅豆杉愈傷組織的

7、生長周期約為45d，延滯期約為5d，第6天到第35天為快速生長期，此后進入穩(wěn)定期，約第50天后愈傷組織開始衰老、褐變。 2,4-D和NAA對愈傷組織的生長和紫杉醇的生物合成均存在交互作用，0.4 mg/L2,4-D+3.2 mg/L NAA對愈傷組織生長最為有利，0.8 mg/L 2,4-D+2.0 mg/L NAA組合明顯有利于愈傷組織紫杉醇的生物合成。 CH不利于南方紅豆杉愈傷組織的生長。 南方紅豆杉愈傷組織

8、中具有較高含量的紫杉烷類化合物。 采用兩種觀測研究愈傷組織生長的方法所獲得的結果比較一致，說明兩種方法均可行。但愈傷組織直徑觀測法因避免了將愈傷組織取出觀測的一系列繁瑣的無菌操作過程而更簡便、易行。 對生長初期愈傷組織，其生長速率隨綠原酸濃度的增加而加快，但紫杉醇含量反而下降。當培養(yǎng)基中綠原酸濃度超過1.0 mg/L后，愈傷組織生長量就不再隨加入綠原酸量的增加而增加。 綠原酸使南方紅豆杉愈傷組織的顏色普遍比對照淺