銅綠假單胞菌SuhB蛋白的功能及其調(diào)控途徑和分子機(jī)制.pdf

1、病原茵致病的基礎(chǔ)是其攜帶的毒性基因，對毒性基因功能和調(diào)控的研究有助于我們了解病原菌的致病過程，并為有針對性的設(shè)計(jì)新型藥物和治療方法提供線索。本實(shí)驗(yàn)室研究的模式菌為銅綠假單胞菌，該菌為條件致病菌，能夠編碼多種毒力因子，其中，Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)和運(yùn)動能力與急性感染相關(guān)，而Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)和生物被膜則與慢性感染有關(guān)。課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌中一個(gè)被命名為suhB的基因?qū)3SS的表達(dá)和致病性起著關(guān)鍵作用，采用小鼠急性肺炎

2、模型發(fā)現(xiàn)suhB基因在體內(nèi)感染中表達(dá)上調(diào)，而且suhB基因的敲除極大地降低了該菌的毒性。
　　在實(shí)驗(yàn)室已有的研究基礎(chǔ)上，在T3SS誘導(dǎo)條件下通過轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)研究suhB缺失突變株和PAK野生型的基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)suhB缺失突變株中exoS、exoT及其他T3SS相關(guān)基因的mRNA水平顯著降低，與鞭毛生物合成有關(guān)的基因表達(dá)水平明顯下降，而與T6SS相關(guān)的基因表達(dá)水平則顯著提高。對運(yùn)動能力表型和T6SS蛋白表達(dá)水平檢

3、測發(fā)現(xiàn)，suhB缺失突變株的泳動能力明顯減弱，T6SS效應(yīng)蛋白Hcp1的表達(dá)顯著增強(qiáng)，與RNA-seq中相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平相一致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SuhB通過控制GacA和RsmY/Z兩種小RNA分子水平的變化來調(diào)節(jié)T3SS、運(yùn)動能力、T6SS和生物被膜相關(guān)基因的表達(dá)。在Δsuh中敲除gacA或rsmY/rsmZ后ExoS的表達(dá)和分泌均得到了部分恢復(fù)，且Hcp1蛋白的表達(dá)水平顯著降低，生物被膜表型消失，說明SuhB在調(diào)控銅綠假單胞菌

4、急性和慢性感染相關(guān)毒力因子之間的轉(zhuǎn)換及致病性方面起著關(guān)鍵作用。
　　為更加明確SuhB調(diào)控途徑中的未知因子，采用親和層析、免疫共沉淀及蛋白質(zhì)組學(xué)手段分析鑒定SuhB相互作用蛋白，發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白及RNA聚合酶β鏈和β'鏈亞基能和SuhB共純化。而且，PA5471、mexX、mexY、PA0826.1及smpB等與蛋白質(zhì)翻譯錯誤及核糖體延宕應(yīng)激響應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)量在ΔsuhB中顯著提高。通過翻譯能力測試發(fā)現(xiàn)ΔsuhB中核糖體的翻譯能力

5、相比野生型降低了1.61倍，說明suhB基因突變以后，核糖體的功能降低，且這種降低導(dǎo)致ΔsuhB菌株的世代時(shí)間延長了近3倍。推測銅綠假單胞菌suhB基因突變以后核糖體穩(wěn)定性降低，沿mRNA鏈移動時(shí)脫落增多，或者在移動時(shí)速度減緩，導(dǎo)致延伸速率和翻譯能力降低;還有可能是SuhB承接著轉(zhuǎn)錄與翻譯的偶聯(lián)，在轉(zhuǎn)錄和翻譯層次上對基因表達(dá)進(jìn)行全局性的調(diào)控，在ΔsuhB菌株中，當(dāng)翻譯受影響時(shí)，轉(zhuǎn)錄也將受到抑制，隨后可能是DNA的復(fù)制障礙，最終將演變成為